三氯乙酸-酶法脱玉米须多糖中蛋白质工艺的优化

周鸿立，张英珍，郭志红

（1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022；2.吉林大学化学学院，吉林长春130000）

三氯乙酸-酶法脱玉米须多糖中蛋白质工艺的优化

周鸿立1，张英珍1，郭志红2

（1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022；2.吉林大学化学学院，吉林长春130000）

通过比较氯化钙法、盐酸法、三氯乙酸法、Sevag和酶法联用法、三氯乙酸和酶法联用法等5种方法对玉米须多糖进行脱蛋白纯化实验，以蛋白脱除率和多糖保留率及综合评分为指标，探寻玉米须多糖最佳脱蛋白质方法。结果三氯乙酸和酶联用法最佳条件为酶底比2.5（mg/L）、温度50℃、水解时间1 h、TCA浓度为25%、样液体积比为4∶1、静置时间为40min，多糖的纯度由13.2%提高到24.2%，蛋白脱除率为60.1%，多糖保留率为87.5%。此工艺条件简便有效，适用于玉米须多糖中蛋白质的脱除。

玉米须；多糖；三氯乙酸-酶；脱蛋白

玉米须是禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱头，现代药理研究证实玉米须多糖有调节免疫、抗肿瘤、保肝、降血糖、利尿、解热、利胆、延长胃排空时间和降低体重等作用且毒性低[1]。有关玉米须多糖提取和活性的报道比较多，分离、纯化相对较少，主要由于采用水提醇沉等方法所得的多糖中常存在一定量的蛋白质，蛋白质具有和多糖相似的溶解性，不能用常规的液液萃取或液固萃取来分离。常用蛋白沉淀剂如三氯乙酸、鞣酸等除去，少量蛋白质可选用Sevag法。实验以蛋白脱除率、多糖保留率为指标比较三氯乙酸和酶法联用进行脱蛋白工艺优化，筛选出适合工业化生产的简单、高效的脱蛋白质方法，为进一步开发利用玉米须提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米须药材2010采自吉林省吉林市郊区；木瓜蛋白酶：广西南宁杰沃利生物有限公司，酶活力6 000 U/mg，sigma分装；考马斯亮蓝G-250：中国惠氏生化试剂有限公司；牛血清白蛋白：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、三氯乙酸、苯酚、浓硫酸等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

循环水式多用真空泵（SHB-IIIA）：郑州长城科工贸有限公司；型旋转蒸发仪（RE-52A）：上海亚荣生化仪器厂；紫外可见分光光度计（725）：山东高密彩虹分析仪器有限公司；分析天平（FA-2004型）：上海精细科技仪器厂；台式离心机（LDZ5-2型）：北京医用离心机有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的制备

玉米须干燥后粉碎，过40目筛。准确称取100 g，用石油醚脱脂后，放入5 000m L的圆底烧瓶中，加蒸馏水约至3 000mL，浸泡过夜，于90℃水浴提取1 h，提取液过滤。第2次加水2 000mL，提取30min，过滤；合并2次滤液浓缩至总体积的1/5，加无水乙醇至体积分数70%以上，静置24 h，3 500 r/min离心5min，回收乙醇，沉淀部分真空干燥得粗多糖。实验时配成0.2%粗多糖溶液，放入冰箱冷藏待用[2]。

1.3.2 多糖和蛋白质的含量测定

多糖含测采用苯酚-浓硫酸法，蛋白质含测采用考马斯亮蓝G-250法[2]。

多糖保留率/%=脱蛋白后多糖含量/脱蛋白前多糖含量×100

蛋白去除率/%=（脱蛋白前蛋白含量－脱蛋白后蛋白含量）/脱蛋白前蛋白含量×100

综合评分=（每次脱蛋白率/每组最高脱蛋白率）× 0.5×100＋（每次多糖保留率/每组最高多糖保留率）× 0.5×100[3]

1.3.3 四种脱蛋白方法的比较

1）盐酸法[4-5]：取多糖液于试管中，调pH为1，20℃放置6 h，4 000 r/min离心，测含量。

2）氯化钙法[6]：取多糖液于试管中，调pH为9，加热至85℃时，加入氯化钙试剂，振摇2min，冷却至室温，4 000 r/min离心，测含量。

3）三氯乙酸法[7]：取多糖液于试管中，加入三氯乙酸，振摇，超声10min，4 000 r/min离心，测含量。

4）酶-Sevag法[3，8]：以酶底比2.5mg/L，取100mL多糖液，调pH为5，加入木瓜蛋白酶0.25mg，50℃恒温1 h，然后沸水浴5min灭酶，冷却至室温后4 000 r/min离心。上清液用Sevag试剂（氯仿-正丁醇体积比为5∶1，样液与试剂体积比为2∶1）脱蛋白2次，每次振荡8min，静置分层，分离后4 000 r/min离心，测含量。

1.3.4 三氯乙酸-酶联用法单因素考察

固定上述木瓜蛋白酶水解玉米须多糖中蛋白的最佳条件[3]，改变三氯乙酸的浓度，体积比，静置时间等三因素，测定多糖和蛋白的吸光度值，并计算脱蛋白率和多糖保留率考察各因素对脱蛋白效果的影响[9]。

1.3.4.1 TCA浓度的选择

取4支试管，准确移取5m L多糖液，分别选取2.5mL不同浓度10%、15%、20%、25%的TCA溶液，摇匀后超声5min，静置30min，离心取上清液。

1.3.4.2 TCA体积的选择

取4支试管，准确移取4、5、5.5、6mL多糖液，再依次加入10%TCA溶液各3、2、1.5、1.0m L，摇匀后超声5min，静置30min，离心取上清液。

1.3.4.3 静置时间的选择

取4支试管，准确移取5mL多糖液和10%TCA 2.5mL，摇匀后超声5min，分别选取静置时间为30、60、120、180min，离心取上清液。

1.3.5 三氯乙酸-酶联用法正交探索实验

在单因素实验的基础上，选取TCA浓度、体积比和静置时间为考察因素，采用三因素三水平正交实验，以脱蛋白率和多糖保留率为指标，筛选最佳脱蛋白条件。正交试验设计见表1。

表1 正交试验设计表Table1 Design of the orthogonal experiment

2 结果

2.1 4种脱蛋白方法的结果

4种脱蛋白方法的结果见图1。

图1 脱蛋白方法比较Fig.1 Compared with the methods of deproteinization

由图1可知，酶法和Sevag联用法脱蛋白率为69.7%，多糖保留率为88.5%，较其它3种方法脱蛋白效果更好，蛋白含量最低，多糖含量最高。多糖纯度由13.2%提高为23.7%。

2.2 单因素试验

2.2.1 TCA浓度的选择

三氯乙酸法脱蛋白浓度影响因素如图2。

图2 TCA浓度因素Fig.2 The concentration factor of TCA

由图2可知随着三氯乙酸浓度的增大，脱蛋白率和多糖保留率都增大，但当三氯乙酸达到0.2时，脱蛋白效果最佳，脱蛋白率为53.2%，多糖保留率89.4%。

2.2.2 TCA体积的选择

三氯乙酸法脱蛋白样品与溶液体积比影响因素如图3。

图3 TCA样液比因素Fig.3 The volume ratio factor of TCA

由图3可知，TCA体积因素的脱蛋白率和多糖保留率，当体积比为3∶1时，脱蛋白效果最佳，脱蛋白率为43.9%，多糖保留率64.9%

2.2.3 静置时间的选择

三氯乙酸法脱蛋白静置时间影响因素如图4。

图4 静置时间因素Fig.4 The factor of standing time

由图4知，随着静置时间的延长，脱蛋白率增加不明显，且多糖保留率有明显降低趋势。故确定最佳静置时间为30min，此时脱蛋白率为48.6%，多糖保留率为89.4%。

2.3 正交试验

通过三因素三水平正交表设计的实验方案，以脱蛋白率和多糖保留率，计算综合评分，见表2。

表2 TCA+酶法正交实验数据处理结果Table2 Results of the orthogonal experiment

由表2可得，正交试验的三因素中，影响关系大小依次为C＞B＞A，最优条件为A2B3C3，即TCA浓度为25%，体积比为4∶1，静置时间为40min。

2.4 验证实验

取正交试验最佳因素组合A2B3C3做3次验证实验，即酶底比2.5（mg/L），温度50℃，水解时间1 h，TCA浓度为25%，体积比为4∶1，静置时间为40min。结果3次脱蛋白率分别为60.3%、59.6%、60.4%，平均值60.1%，RSD 0.72%＜1.0%；多糖保留率为87.9%、87.1%、87.5%，平均值87.5%，RSD 0.46%＜1.0%，综合评分97.8；多糖纯度由13.2%提高为24.2%。验证所确定的工艺条件为最优条件，并稳定可行。

3 结论

采用5种脱蛋白方法，其中氯化钙法操作简单、试剂廉价，但脱蛋白效果较其他方法差；盐酸法脱蛋白效果相对较好，简单易操作，但由于强酸性会使一部分多糖降解，并降低多糖的活性。三氯乙酸法使蛋白质构象发生改变，与蛋白质形成不溶性盐，使之聚集沉淀除去，操作简单，结果稳定，其有蛋白脱除效果较好，但反应较为强烈，易引起植物多糖的降解，多糖保留率相对联合酶法偏低的缺点[8]。且有一定的化学试剂的残留，脱除这些残留试剂增加了后序的工作量。Sevag+酶法联用，最佳工艺为氯仿-正丁醇体积比为5∶1，样液与试剂体积比为2∶1，振荡时间8min，脱蛋白次数2次，脱蛋白率69.7%，剩余率88.5%，多糖纯度为23.7%。原料经酶处理后，大部分游离蛋白被水解，经过2次Sevag法脱蛋白处理，蛋白脱除率和多糖保留率相对而言都很高，可达到理想的去除蛋白的效果[10]，该方法的不足之处是脱蛋白过程中会除去浸提料液中糖蛋白等活性成分，并有易制毒化学试剂氯仿的残留，因此所得多糖的应用会受到限制。TCA+酶法优化玉米须多糖脱蛋白的工艺，最佳条件为TCA浓度为25%，体积比为4∶1，静置时间为40min，脱蛋白次数1次，蛋白脱除率为60.1%，多糖保留率为87.5%，多糖纯度由13.2%提高为24.2%。

综合结果认为，TCA+酶法脱蛋白效果相对经济实用。两种与酶联用的方法得到纯化多糖中仍含有少量蛋白质，要得到纯多糖制品，还需经过进一步纯化，是否为糖蛋白复合物也需验证。总之，由于多糖的复杂性，其提取纯化工艺的研究，不能单纯考察纯度，还应注意损失率，以及结构与活性之间的相关性。

[1]周鸿立,张艳,金海甲,等.玉米须多糖药理作用及提取纯化研究进展[J].吉林化工学院学报,2009,26(1):23-26

[2] 周鸿立,肖振晶,张丽杰,等.玉米须多糖的提取及脱蛋白研究[J].安徽农业科学,2009,37(34):10782-17084

[3] 周鸿立,杨晓红.玉米须多糖中蛋白质脱除的Sevag与酶法联用工艺优化[J].食品科学,2011,32(8):129-132

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Optimum Deproteinization of Polysaccharide from Corn Silk by Trichloroacetic Acid-Enzyme

ZHOU Hong-li1，ZHANG Ying-zhen1，GUO Zhi-hong2
（1.Jilin Institute of Chemical Technology，College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin 132022，Jilin，China；2.College of Chemistry，Jilin University，Changchun 130000，Jilin，China）

To explore the optimum deproteinization conditions of crude polysaccharide from corn silk by compared with the five methods of calcium chloride，hydrochloric acid，trichloroacetic acid，sevag-enzyme and trichloroacetic acid-enzyme.The deproteinization rate，the remaining rate of polysaccharide and the comprehensive score were regarded as indexes.The optimum conditions of deproteinization by combined TCA and enzyme were the ratio between the enzyme and the solution 0.25%（g/L），temperature of 50℃，reaction time of1 h，TCA concentration of 25%，volume ratio of4∶1，standing time of 40min.Eventually the purity of crude polysaccharide was increased from 13.2%to 24.2%，the deproteinization rate was 60.1%，and the remaining rate was 87.5%.This method can be used as process method of deproteinization from corn silk，because the optimum technology is simple and efficient.

corn silk；polysaccharide；TCA-enzyme；deproteinization

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.016

2013-10-28

吉林省科技厅科研项目（20130303050NY）；吉林省教育厅科研项目（2013319）；吉林化工学院科研项目（2014059）

周鸿立（1967—），女（汉），教授，博士，从事天然产物的研究与开发。