凉茶中DNA提取方法的建立

王立平，蔡雪凤，刘晓莉，曹悦，李树垚

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

凉茶中DNA提取方法的建立

王立平，蔡雪凤，刘晓莉，曹悦，李树垚

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

以凉茶植物源性饮品为研究对象，比较了1种硅胶柱法商品试剂盒和传统CTAB法提取凉茶食品基因组DNA的效果；通过紫外分析法和实时荧光定量PCR法对所提取的DNA进行检测，比较所得DNA的浓度和纯度，以及对下游检测的适用性。结果表明，与传统CTAB法相比，研究所建立的方法提取到的DNA无PCR抑制剂，浓度和纯度能满足后续PCR检测要求。

凉茶；核酸提取；方法比较

凉茶是我国南方沿海地区居民根据当地气候、水土特性，在长期预防疾病与保健的过程中以中医养生理论为指导，以天然中草药，如金钱草、布渣叶、岗梅根、木蝴蝶、火炭毋、淡竹叶、金沙藤、五指柑等为原料，用独特的煲制方法煎熬而成的一种汤剂，具有清热解毒、生津止渴、防治疾病等功效，也是民间世代流传的被广泛饮用的传统保健饮品。但目前在凉茶原材料来源上存在一些问题，如药材种类掺假。炒的沸沸扬扬的金银花门事件，就是用价格低廉的山银花冒充金银花。要实现对凉茶中中草药成分真实性鉴定可借助于PCR（聚合酶链式反应）技术手段。通过提取残留于凉茶中的特定药材的DNA（脱氧核糖核酸）片段，设计适宜引物，扩增目标片段，借助琼脂糖电泳技术或实时荧光定量PCR技术可实现中药材真实性鉴定。

但PCR方法鉴定准确性与稳定性的重要前提条件是所提取DNA的浓度和质量，而这取决于DNA提取方法，特别是对PCR抑制剂的有效去除。已报道的PCR抑制剂有：NaCl、二价盐、SDS（十二烷基磺酸钠）、粪便中的多糖、尿中的尿素、血液中的血红素、牛奶中的蛋白酶、土壤中的腐殖质等等[1-2]。这些抑制剂一般是通过以下几种方式单一或混合进行抑制：（1）干扰细胞裂解；（2）解或捕获核酸；（3）使DNA聚合酶失活或活性降低[1，3]。

凉茶中成分复杂，工艺过程需经过加热熬制，导致植物DNA片段断裂和破碎；凉茶中所生成的色素成分对后续PCR反应过程所产生的抑制作用，导致PCR检测的失败。因此，所采用DNA提取方法，获取高纯度的目标DNA片段至关重要。

目前在植物源食品中提取DNA的方法主要有传统CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法，SDS法，硅胶柱试剂盒法，磁珠试剂盒法[4-5]。但如何获取凉茶中高质量的DNA的提取方法至今尚无研究报道。在本实验中考虑到PCR抑制剂的影响，采用了硅胶柱提取DNA的方法，并与传统CTAB法加以比较，确定最适宜的凉茶中DNA的提取方法。

1 材料与方法

1.1 试剂材料及仪器设备

1.1.1 试剂材料

市售不同品牌的凉茶；FeCl3·6H2O；乙二醇、三乙二醇、醋酸钠；十二烷基硫酸钠、聚乙二醇8000、四乙氧基硅烷（TEOS）；CTAB；NaCl；蛋白酶K；盐酸胍；琼脂糖；PCR试剂（天根生物技术公司）；D Neasy mericon Food Kit（QIAGEN）；DNA marker（50 bp～450 bp）。

1.1.2 引物和探针

PCR采用植物18SrDNA基因为靶序列的引物[6]。上游引物：5’-CCTGAG AAA CGGCTA CCA T-3’下游引物：5’-CGT GTC AGG ATT GGG TAA T-3’探针：5’FAM-TGC GCG CCT GCT GCC TTC CT-3'TAMRA。

1.1.3 仪器设备

凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）；核酸蛋白微量定量仪（Nano Drop，美国）；高速离心机（SIGMA，德国）；实时荧光PCR仪（ABI7300，美国）。

1.2 试验方法

1.2.1 两种凉茶中DNA提取方法

CTAB法：见参考文献[7]；Qiagen硅胶柱法：实验步骤见说明书。

1.2.2 提取基因组DNA的紫外分光光度检测

用紫外分光光度计检测基因组DNA在260 nm处的吸光值（A260），计算所提DNA的浓度，DNA的质量浓度（μg/mL）=A260×50。检测基因组DNA在260、280 nm处的吸光值，根据A260/A280值判断DNA纯度。

1.2.3 Rea1-Time PCR初步扩增体系

反应体系为25.0μL。Master Mix：10μL；上、下游引物（10μmol/L）：各1.0μL；分子信标探针（5.0μmol/L）：1μL；probe Enhancer solution：1.25μL；DNA模板：10.75μL。实时荧光反应条件：50℃2min；95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40个循环。每个模板DNA均做2个平行。

1.2.4 检测抑制剂

以提取的样品DNA液8.75μL为抑制剂，以大豆提取的DNA为阳性模板，按1.2.3Rea1-Time PCR进行扩增检测，确定所提取的样品DNA中是否有PCR抑制剂的存在和干扰。

2 结果与讨论

2.1 两种DNA方法提取结果的比较

凉茶是中草药深加工制品，DNA在加工过程中不可避免受到损伤、断裂和降解。且所含的植物多糖和色素，对提取样品总DNA效率及纯度产生一定影响，进而影响下一步实验结果的判定。因此，采用两种方法提取凉茶中的DNA，比较结果见表1。

表1 凉茶中总DNA提取方法比较（DNA浓度为（ng/μL））Table 1 Comparison of QIAquickRSpin Columns DNA extraction kit and CTAB method

从表1中可看出，不同的DNA提取方法所获取DNA提取液的浓度和纯度存在一定差异。在DNA提取液颜色上，传统CTAB法DNA提取液呈淡黄色，而采用Qiagen硅胶柱法提取的DNA为正常的无色透明液体。在260/280的比值方面，两种DNA提取液的260/280的比值范围波动较大，传统CTAB法提取液260/280的比值在0.98～1.15之间。可能是在提取过程中植物多糖去除效果不好，导致DNA提取液中植物多糖含量高。提取液中DNA浓度差别较大，从几ng/μL～几十ng/μL不等。从以上结果看到，不同的DNA提取方法，由于所采用的机理不同，提取的效果确实存在一定差异。考虑到凉茶为深加工制品，植物中DNA在产品加工生产过程中的加热熬制导致DNA降解，断裂为小片段。因此，DNA提取液的260/280的比值、颜色及浓度可为下一步实验提供参考。

2.2 两种方法提取DNARea1-Time PCR结果

以两种方法提取的凉茶的基因组DNA为模板，采用植物18SrDNA序列设计的引物和探针分别对市售的三种凉茶提取的DNA进行Rea1-Time PCR扩增测定，确定两种提取方法的可行性，结果见图1和图2。

图1 CTAB法Real-Time PCR扩增曲线Fig.1 The curve of Real-Tim e PCR by CTAB method

图2 Qiagen硅胶柱法Real-Time PCR扩增曲线Fig.2 The curve of Real-Time PCR by Qiagen spin columns DNA extraction method

从Rea1-Time PCR扩增曲线可知，除阳性对照有明显扩增曲线外，采用Qiagen硅胶柱提取试剂盒提取的三种凉茶DNA有扩增曲线；而传统CTAB法获取的三种凉茶DNA均无明显的扩增曲线；从2.1中测定结果可知，采用Qiagen硅胶柱提取试剂盒提取的三种凉茶DNA含量低于传统CTAB法。因此推测传统CTAB法获得的DNA液中可能存在PCR抑制物质。所做的推测有待下一步实验进行验证。

2.3 抑制剂检测结果

以大豆提取的DNA为阳性模板，在Real-Time PCR反应体系（25.0μL）中添加体积为2.0μL（100.0 ng/μL），同时在每个反应体系中添加8.75μL的传统CTAB法获取的三种凉茶DNA液，添加引物、探针及Master mix后进行Real-Time PCR，检测DNA提取液中是否存在PCR抑制剂。结果见图3。

图3 CTAB法抑制剂Real-Time PCR扩增曲线Fig.3 The curve of Real-Time PCR by CTAB method containing PCR inhibitors

从图3的Rea1-Time PCR扩增曲线图可知，除阳性对照有明显扩增曲线外，传统CTAB法提取的三种凉茶DNA均含有PCR抑制剂，导致添加该三种方法提取的DNA液的阳性样品无扩增曲线。该结果表明，传统CTAB法不能有效去除样品中PCR抑制剂，特别是色素类的PCR抑制剂。目前，对于如何去除DNA提取液中PCR抑制剂有相关的研究报道[8]。利用去除PCR抑制剂物质能否有效去除DNA提取液中PCR抑制剂有待下一步研究。

3 结论

凉茶含有糖类、蛋白质类、及色素类物质等，这些物质直接影响着PCR以及荧光PCR反应中Taq酶的活性，并且对荧光PCR的定量结果有着更大的影响。因此建立提取该类产品基因的方法得到质量较好的基因组DNA至关重要。本实验中，与传统CTAB法相比较，Qiagen硅胶柱提取法在获取目标DNA片段更具优势，能获得较好质量的凉茶产品中的DNA片段，能满足下一步实验的要求。

[1] Waleed A A,Peter R.Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-Inhibiting samples[J].Appl Environ Microbiol,1998,64(10):3748-3753

[2]Lantz P G,Matsson M,Wadstrom T.Removal of PCR inhibitors from human fecal samples through the use of an aqueous two-phase system for sample preparation prior to PCR[J].J Microbiol Methods, 1997,28(3):159-167

[3] Wilson I G.Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification [J].Appl Environ Microbiol,1997,63(10):3741-3751

[4] Clelia Peano,Maria Cristina Samson,Luisa Palmieri.Qualitative and quantitative evaluation of the genomic DNA extracted from GMO and Non-GMO food stuffs with four different extraction methods[J].Agricultural and Food Chemistry,2004,52(23):6962-6968

[5] Philippe Corbisier,Wim Brootharets,Sabrina Gioria.Toward metrological traceability for DNA fragment ratios in GM quantification.1. Effect of DNA extraction methods on the quantitative determination of Bt176 Corn by Real-Time PCR[J].Agricultural and Food Chemistry,2007,55(9):3249-3257

[6] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会.SN/T 1204-2003植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法[OL].http://down.foodnate.ne/standard/sort/4/9362.htm l.[2003-03-17]

[7]邵碧英,王德峰,傅碧忠,等.酱油、烤鳗酱油DNA提取及原料成分的荧光PCR检测[J].食品科学,2009,30(22):240-243

[8]Matina Kovarova,Petr Draber.New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions[J].Nucleic Acids Research,2000,28 (13):1-5

DNA Extraction Methods of Herbal Tea

WANG Li-ping，CAI Xue-feng，LIU Xiao-li，CAO Yue，LI Shu-yao
（China National Food Quality＆Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Two current DNA extraction methods for processed foods of herbal tea were compared in the study. These methods included one kind of QI AquickRSpin Columns DNA extraction kits and CTAB method.The extracted DNA were detected to compare concentration，purity and suitability to posterior detection by UV analysis，fluorescence quantification PCR.The results showed that the purity of and concentration extracted DNA from herbal tea was without PCR inhibitor by our established method and could meet the requirement of posterior PCR detection.

herbal tea；DNA extraction；methods comparison

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.022

2013-12-11

王立平（1968—），女（蒙古），高级工程师，博士，主要研究方向：食品微生物。