食用菌深层发酵物中生物活性物质含量的比较

金红，杨孝丽，任灿，徐娜，王英超，张斌

（1.天津农学院农学与资源环境学院，天津300384；2.天津农学院基础科学学院，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

食用菌深层发酵物中生物活性物质含量的比较

金红1，杨孝丽1，任灿1，徐娜1，王英超2，张斌3，*

（1.天津农学院农学与资源环境学院，天津300384；2.天津农学院基础科学学院，天津300384；3.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

食用菌深层发酵物中含有很多与免疫相关的生物活性物质。本文以白灵菇、金针菇、茶树菇、平菇、香菇、桑黄、云芝和灰树花八种食用菌为实验材料，利用摇瓶深层发酵技术，对相同发酵条件下，8种食用菌发酵物中的胞外多糖、胞内多糖、黄酮、总酚、VC和可溶性蛋白含量进行了比较。结果表明，灰树花深层发酵物中总多糖产量最高为0.349g/100mL，桑黄中的黄酮和可溶性蛋白的产量最高分别为3.92μmol/100mL和0.58mg/mL，云芝中的VC产量最高为19.95 g/100mg，金针菇的总酚产量最高为5.07mg/100m L。通过比较，白灵菇的综合指标表现最好，以白灵菇为实验材料进行发酵罐深层发酵，比较摇瓶与发酵罐深层发酵液中各物质的含量变化。结果表明，在发酵罐条件下，白灵菇的胞外多糖和胞内多糖产量明显提高，但黄酮和VC产量增幅不大，说明发酵条件对发酵物中活性物质产量有很大的影响。

食用菌；深层发酵；多糖；黄酮；VC

食用菌深层发酵技术是一种新型的技术，具有周期短、产量高、产生的活性物质多、菌体污染少等特点[1]。我国拥有极其丰富的高等真菌资源，随着现代科学技术的发展，目前，食用菌深层发酵技术日趋成熟，但如何有效地利用深层发酵物中的生物活性物质仍处于研究阶段，多数以研究单一菌种的发酵技术为主[2]。摸清一些常用食用真菌深层发酵液中生物活性物质的成分，特别是对它们的发酵液成分作以横向比较，对这些活性物质进行有效的混合利用，开发功能食品和生物制剂具有主要意义。由于食用菌发酵物中含有多种与免疫相关的活性物质，对提高机体的免疫技能，克服抗生素和疫苗的副作用，具有较好的作用。本文以8种常见食用菌为研究材料，通过摇瓶深层发酵培养，测定其发酵液中多糖、黄酮等多个与免疫相关的物质含量，筛选出各指标较高的食用菌，并对其进行发酵罐深层发酵初探，为食用菌深层发酵物的混合加工利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

食用菌：白灵菇、金针菇、茶树菇、香菇、平菇、云芝、桑黄和灰树花：均由天津农学院农学与资源环境学院生物技术系班立桐老师惠赠。

1.2 主要设备和仪器

75-23型可见分光光度计：天津喀纳斯光学分析仪器有限公司；HZQ-Q型全温振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；LGJ-18S型冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；TGL16A型高速冷冻离心机：福建凯达集团有限公司；GBJT-7AUTOBIO2000型7L发酵罐：镇江东方生物工程设备技术公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基的配制

1.3.1.1 种子培养基

1%蔗糖、0.5%蛋白胨、0.05%KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、10mg/LVB1；

1.3.1.2 摇瓶深层发酵液体培养基

3%蔗糖、2%玉米粉、4%麸皮、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O；

1.3.1.3 白灵菇发酵罐深层发酵液体培养基

0.5%葡萄糖、0.5%蔗糖、5%玉米粉、4%麸皮、0.2%蛋白胨、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、0.5%羧甲基纤维素钠、VB1微量。

1.3.2 8种食用菌摇瓶深层发酵培养方法

取0.5 cm2大小的各菌块接种在斜面培养基的中部，25℃下暗培养。待各菌生长旺盛时，各取2块0.5cm2大小的菌块分别接种到相应的100mL种子液培养基中，25℃，170 r/min摇床培养7 d。取10mL各菌种的种子液分别接种到相应的90m L发酵培养基中，25℃，170 r/min摇床继续培养7 d。

1.3.3 8种食用菌发酵液多糖的提取及含量测定

将发酵液于3 600 r/min离心20min，取下层沉淀，用蒸馏水冲洗3次，放入60℃干燥箱中烘至恒重。将恒重的菌丝体研磨成粉末用于提取胞内多糖，方法参照文献进行[3-4]。提取胞外多糖时，将发酵液3 600 r/ min离心20min，收集上清液。60℃旋转蒸发浓缩至1/ 4体积，加入3倍体积预冷的95%乙醇，于4℃冰箱中醇析24 h，4 200 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀分别用无水乙醇、乙醚和丙酮清洗数次，然后再加入一定体积60℃热水，使沉淀充分溶解，得胞外多糖溶液。多糖含量的测定参照文献进行[5-7]。

1.3.4 8种食用菌发酵液中黄酮和总酚的提取和含量测定

取发酵液于3 600 r/min离心20min。取15mL上清液于-20℃冰箱中冻实，然后放入冷冻干燥机24 h，待浓缩至原液1/5，停止干燥。黄酮的测定方法采用NaNO2-Al（NO3）3比色法，参照文献进行[8]；测定总酚时，将发酵液全部转入离心管中，3 000 r/min离心15min，取上清。将样品浓缩到吸光度值范围内。测定方法参照文献进行[9]。

1.3.5 8种食用菌发酵液中VC的含量测定

取发酵液于3 600 r/min离心20min，取上清液40mL置于冷冻干燥机干燥成粉末后，2%草酸溶解，定容至40m L。含量测定采用2，6-二氯酚靛酚法，参照文献进行[10]。

1.3.6 8种食用菌发酵液中菌丝体干重和可溶性蛋白含量的测定

将发酵液于3 000 r/min离心10min，得到菌丝体，搅碎，用蒸馏水洗涤3次，3 000 r/min离心10min后，60℃烘干至恒重，菌丝体干重测定参照文献进行[8]；测定可溶性蛋白时，将发酵液转入离心管中，3 000 r/min离心15min，取上清。参照文献的方法进行[10]。由于样品颜色较深，将样品稀释到吸光度值范围内。

1.3.7 白灵菇发酵罐深层发酵条件

7 L发酵罐装培养基4.5 L，接种量10%，温度25℃，初始搅拌转速300 r/min，pH 6，罐压0.08MPa，通气量1 vvm，通过改变转速和增加罐压调节溶氧，发酵培养5 d。

2 结果与分析

2.1 8种食用菌摇瓶发酵液中多糖的比较分析

取8种食用菌的摇瓶深层发酵液，按照1.3.3的方法分别提取胞内多糖和胞外多糖和测定其含量，结果见表1。

从表1中可以看出，八种食用菌深层发酵物中胞外多糖和胞内多糖含量高低呈现出大致相同的趋势，胞外多糖含量从高到低前三名依次为香菇>灰树花>白灵菇，胞内多糖含量从高到低前三名依次为灰树花>白灵菇>金针菇。说明在本研究中采用相同的实验条件下，该实验条件比较适合香菇深层发酵物胞外多糖的产生，达0.134 g/100mL，是产量最低的云芝的2.39倍；也比较有利于灰树花深层发酵物中胞内多糖的产生，达到0.218 g/100mL，是产量最低的云芝的4.11倍。而多糖总含量则是灰树花的最高，达到0.349 g/100mL，其次是白灵菇和香菇。日本学者通过对灰树花发酵液成份的研究发现：其中的灰树花胞外多糖是发酵液主要的生物活性成份[11]。大量的药理药效的研究证明，灰树花胞外多糖在抗肿瘤、抗HIV病毒以及防治糖尿病、高血压、高血脂、肥胖症、老年痴呆症等方面具有良好的效果，有些方面甚至超过临床效果较好的香菇多糖。

表1 8种食用菌摇瓶深层发酵液中多糖含量的比较Table1 Comparison of contents of polysaccharides of eight edible fungus fermentation products

2.2 8种食用菌摇瓶发酵液中黄酮和总酚含量的比较分析

取2种食用菌的摇瓶深层发酵液，按照1.3.4和1.3.5的方法分别测定黄酮、总酚和VC的含量，结果见表2。

表2 8种食用菌摇瓶深层发酵物中黄酮、总酚和VC的含量比较Table 2 Comparison of contents of flavonoids,total phenols and VCin eight edible fungus fermentation products

从表2可以看出，8种食用菌深层发酵也中黄酮含量相对差异变化不是很大，变化范围为2.72μmol/ 100m L～3.92μmol/100m L。高低前三名的依次为：桑黄>白灵菇>平菇；总酚含量前三名为：金针菇＞灰树花＞平菇。金针菇的总酚含量最高为5.07mg/100mL，是最低的白灵菇总酚含量的5倍；维生素C含量则差异很大，变化范围达到1.77mg/100mL～19.95mg/100mL，VC含量前三名依次为云芝＞白灵菇＞金针菇。

2.3 8种食用菌摇瓶发酵液中菌丝干重和可溶性蛋白含量的比较分析

取8种食用菌的摇瓶深层发酵液，按照1.3.6的方法分别测定可溶性蛋白含量以及菌丝体干重，结果见表3。

表3 8种食用菌摇瓶深层发酵物中可溶性蛋白含量和菌丝体干重的比较Table3 Comparison of contents of soluble protein and dry weight of mycelium of eight edible fungus fermentation products

由表3可以看出，这8种样品的发酵上清液中均含有蛋白质，且含量由大到小的顺序为：桑黄＞云芝＞白灵菇＞平菇＞金针菇＞香菇＞茶树菇＞灰树花。桑黄蛋白质含量最高，即0.579 2mg/mL，云芝和白灵菇也很高，分别为0.292 2mg/mL和0.284 5mg/mL，而且相差不大。灰树花的蛋白质含量最低为0.157 1mg/mL。桑黄的蛋白质含量是灰树花的4倍。从菌丝体干重看，这8种发酵液的菌丝体干重由大到小的顺序为：白灵菇＞金针菇＞平菇＞灰树花＞茶树菇＞香菇＞桑黄＞云芝。白灵菇的菌丝体干重最高为1.92 g/100m L，而云芝菌丝体干重最低为0.71 g/100mL。

2.4 白灵菇发酵罐深层发酵下多糖等物质含量的变化

通过比较表1～表3，对八种食用菌摇瓶深层发酵液中的多糖、黄酮、总酚、VC和可溶性蛋白含量等5个指标进行综合比较，表现较好的为白灵菇。所以，为了探讨在发酵罐深层发酵条件下，是否会提高各种物质的含量，选取白灵菇作为发酵罐深层发酵的菌种。经发酵罐深层发酵后分别测定各物质的含量，结果见表4。

从表4中可见，以发酵罐的方式进行深层发酵，发酵液中各物质的产量均有提高，但增加的幅度不同，胞外多糖和胞内多糖的产量分别增加了3.12倍和1.86倍，而总多糖含量增加了3.29倍；总酚量增加2.44倍；黄酮、和VC产量增加的幅度略小些，说明该发酵条件下比较适合于多糖的产生，而对黄酮、可溶性蛋白和VC产量的增加不太适合。发酵时不同的发酵方式，会对发酵产物含量产生较大的影响。

表4 白灵菇在摇瓶和发酵罐两种深层发酵条件下发酵液中各物质含量的比较Table4 Comparison of contents of materials above from pleurotus nebrodensis submerged ferments under two different conditions

3 结论与讨论

1）从8种食用菌摇瓶深层发酵液中各指标的测定结果可以得出，在发酵条件、培养时间相同时，灰树花深层发酵物中总多糖和胞内多糖产量最高，桑黄中的黄酮和可溶性蛋白产量最高，云芝中的VC产量最高，金针菇的总酚产量最高。由于每种食用菌具有各自最适的培养条件，如pH、温度、转速及生长周期等，为了比较八种菌的发酵物中各物质的产量，本研究采用了相同的培养条件。但同时也出现一个问题，就是测定时各种代谢产物可能不是其产量最高的时期，如测定桑黄深层发酵物中黄酮的含量时，第9天的黄酮含量0.0416μmol/mL，稍高于第7天测定时的0.0392μmol/mL。所以，针对具体的食用菌种发酵液中某个物质应选用其最适的发酵条件。

2）摇瓶发酵和发酵罐发酵是深层发酵的两种方式。从两种条件下深层发酵物中各指标含量的结果可以发现，发酵罐具有明显的优势。它可以通过补料，调节pH、温度、溶氧等使食用菌处于最佳的生长状态，同时也便于在线观测参数变化，更好地掌握发酵周期，及时取样和下罐。通过白灵菇两种深层发酵方式的测定结果可以看出，培养基的碳源、氮源以及培养时间发生变化时对多糖、黄酮和VC等的产量有不同的影响，其中多糖产量大幅度提高，而黄酮和VC的产量增幅不大，这可能是由于碳氮源的变化更有利于多糖的产生，也可能是发酵时间太短，诸如黄酮和VC等次级代谢产物还未大量积累。培养基中的营养物质和环境因素很大程度上影响着发酵物中次生代谢物的产量，所以发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐和生长因子以及发酵条件如装液量、接种量、起始pH、培养温度、转速和接种菌龄对食用菌深层发酵物产量都可能产生重要的影响，这一点有待于进一步研究。

3）食用菌深层发酵过程中产生的诸如多糖、黄酮、总酚和VC等具有生理活性的物质对于提高免疫、抗肿瘤、抗细菌病毒均有作用。如VC可起预防、促进免疫球蛋白合成、提高白细胞吞噬能力等作用。如吞噬细胞对VC的需求比其他细胞高出50倍。据查，猕猴桃的VC含量为62mg/100 g，辣椒的为59mg/100 g，而本研究中云芝的摇瓶发酵液和白灵菇的发酵罐深层发酵液中的VC含量就可达到19.95mg/100 g和16.10mg/100 g。可见，合理利用食用菌深层发酵液并进行混合使用，用于制备免疫增强的功能食品将会产生很可观的社会效益和经济效益。

[1] 赵永勋.食用菌液体发酵的现状和展望[J].农业科学与技术,2004, 24(3):111-114

[2] 郭尚,王慧娟.食用菌深层发酵技术及应用[J].山西农业科学, 2013,41(8):885-888

[3] 林增祥.阿魏菇深层发酵极其多糖的研究与应用[D].新疆:新疆大学,2007:37-43

[4] Eun Jae Cho,Jung Young Oh,Hyun You Chang,etal.Production of exopolysaccharides by submerged mycelial culture of a mushroom Tremella fuciformis[J].Journal of biotechnology,2006,127(1):129-140

[5]傅樱花.金针菇液体深层发酵多糖的提取与测定[N].新疆大学学报,2005,22(1):76-77

[6]胡顺珍.产胞外多糖白灵菇液体培养条件优化及多糖组成分析[D].山东:山东农业大学,2007:20-23

[7]张金波.阿魏侧耳深层发酵条件及其胞外多糖理化性质的研究[D].武汉:华中农业大学,2005:11-12

[8]金红星,胡炎华,成文玉.可见分光光度法测定米曲发酵液中总黄酮[J].中国酿造,2009(9):142-144

[9] 潘英明,李海云,王恒山,等.桂花种子皮黑色素总酚含量的测定及其脂质抗氧化活性研究[J].食品研究与发,2005,26(5):145-148

[10]张云贵,刘祥云,李天俊.生物化学实验指导[M].中国农业出版社, 2007:55-57,198-200

[11]Ohno N,Adachi Y,Suzuki L,et al.Characterization of the antitumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa[J].Chen Pharm Bull(Tokyo),1986,34(4):1709-1715

The Comparison of the Contents of Bioactive Substances in Edible Fungus by Submerged Ferments

JIN Hong1，YANG Xiao-li1，REN Can1，XU Na1，WANG Ying-chao2，ZHANG Bin3，*
（1.College of Agronomy and Resources Environment，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；2College of Basic Sciences，Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；3.Tianjin Institute of Food Co.，LTD.，Tianjin 301609，China）

The submerged ferments of edible fungus contain many biologically active substances related to the immune.In this study，we made a compared research about the contents of extracellular polysaccharides，intracellular polysaccharides，flavonoids vitamin C and soluble protein of eight edible fungus including pleurotus nebrodensis，flammulina velutipes，agrocybe cylindracea，pleurotus ostreatus，lentinula edodes，phellinus，coriolus versicolor and grifola frondosa under the flask cultural condition of submerged fermentation. Results showed that The total yield of polysaccharide of grifola frondosa，flavonoids and soluble protein yield of phellinus，the yield of vitamin C of coriolus versicolor，the yield of total phenols of flammulina velutipes reached the top，they were respectively 0.349 g/100m L，3.92μmol/100m L and 0.58mg/m L，19.95 g/100mg，5.07 mg/100 mL.By comparison，pleurotus nebrodensis showed the best among all comprehensive targets. Next，the pleurotus nebrodensis was cultivated in a stirred-tank bioreactor.The contents of extracellular polysaccharides and intracellular polysaccharides were obviously increased，but the contents of flavonoids and vitamin C were increased a little，which was noted that the fermentation condition had a great effect on the contents of fermentation products.

edible fungi；submerged fermentation；polysaccharide；flavonoids；vitamin C

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.023

2014-10-23

天津市市级大学生创新创业训练计划项目（201410061092）

金红（1967—），女（汉），研究员，硕士，研究方向：转基因检测与生物分离工程。

*通信作者：张斌（1984—），男（汉），工程师，硕士，研究方向：保健功能食品加工与评价。