HPLC法测定面粉中曲酸和过氧化苯甲酰的含量

晏龙，张学忠，谭建林，牛之瑞，任新军，冯雷

（云南省产品质量监督检验研究院，云南昆明650223）

HPLC法测定面粉中曲酸和过氧化苯甲酰的含量

晏龙，张学忠，谭建林*，牛之瑞，任新军，冯雷

（云南省产品质量监督检验研究院，云南昆明650223）

建立了面粉中曲酸和过氧化苯甲酰的高效液相色谱法的分析方法。面粉经水浸泡提取，甲醇定容后，取滤液经C18柱分离，以甲醇和0.02mol/L乙酸铵为流动相，采用PDA检测器对样品进行检测，检测波长为230 nm和270 nm。结果表明，在1μg/mL～50μg/mL添加范围内曲酸呈现良好的线性关系，R2=0.999 7，回收率在98.8%～99.7%，方法的检出限为1.0μg/g；在0.5μg/mL～25μg/mL添加范围内过氧化苯甲酰呈现良好的线性关系，R2=0.999 9，回收率在97.2%～99.4%之间，方法的检出限为0.5μg/g。

面粉；曲酸；过氧化苯甲酰；高效液相色谱法

曲酸是一种新型的生物天然防腐剂，是由医药级原料经微生物发酵制成的具弱酸性的有机化合物[1]。曲酸应用广泛，在食品领域主要可以作为一种添加剂，起到保鲜、防腐、抗氧化作用[1-2]。曲酸在中国还未认定有致癌性，但南京大学化学系的有关专家认为曲酸分子式中的吡喃是与苯一样的方向性化合物，从理论上讲是和苯一样有致癌性[3]。此外曲酸中的羟基也可使人体内积累游离基，这也有致癌性[4]。日本政府指出曲酸具有致癌性，禁止将曲酸作为食品添加剂使用[5]。过氧化苯甲酰是一种强氧化剂，极不稳定，易燃烧。过氧化苯甲酰能对面粉起到漂白和防腐的作用，过氧化苯甲酰易水解成苯甲酸，而过多苯甲酸可能会导致肝、肾出现病理变化[6-7]。2011年5月1日起，卫生部禁止在面粉的生产中添加过氧化苯甲酰。

目前大多数文献都采用比色法[8-9]、高效液相色谱法[10-11]和高效液相色谱-串联质谱法[3]对曲酸和过氧化苯甲酰进行单独检，本文采取水-甲醇体系提取面粉中曲酸和过氧化苯甲酰，过氧化苯甲酰水解成苯甲酸，然后使用高效液相色谱法同时检测面粉中曲酸和苯甲酸的含量。

1 材料与方法

1.1 试剂

曲酸（纯度﹥99%）、过氧化苯甲酰标准品（纯度﹥99%）：百灵威；苯甲酸（1.00mg/mL）：国家标准物质中心；甲醇（色谱纯）：德国Meker公司；超纯水（＞18.2 MΩ）：德国Sartorius公司；乙酸铵（分析纯）：上海试四赫维化工有限公司；冰乙酸（分析纯）：上海申博化工有限公司。

0.02mol/L乙酸铵溶液：称取1.54 g乙酸铵用水溶解，调节pH在5～6，用水定容至1 L。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪：日本Shimadzu公司LC-20A型，PDA检测器；电子天平：德国Sartorius公司CPA225D型；0.22μm微孔有机系滤膜：天津津腾公司。

1.3 标准品的配制

准确称取曲酸的标准品0.01 g于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/mL的一级标准储备溶液，于4℃避光保存。取曲酸一级标准储备液0.5mL和苯甲酸标准品0.25mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得曲酸和苯甲酸的二级标准储备液，于4℃避光保存。临用前，用水将二级标准储备液逐级稀释成标准工作溶液（曲酸1、5、10、25、50μg/mL；苯甲酸0.5、2.5、5、12.5、25μg/mL）。

准确称取过氧化苯甲酰的标准品0.01 g于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到1.0mg/mL的一级标准储备溶液，于4℃避光保存。取曲酸一级标准储备液0.5mL和过氧化苯甲酰一级标准储备液0.25mL于10mL容量瓶中，用水定容，得曲酸和过氧化苯甲酰混合标液，于4℃避光保存，待加标使用。

1.4 色谱条件

色谱柱为Inertsil ODS-SP（C18：5μm，4.6×150mm Column），流动相A为0.02mol/L乙酸铵溶液，流动相B为甲醇，流速：1.0mL/min；检测波长：230 nm，进样量：10μL；柱温：35℃，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table1 Gradient elution program

1.5 样品前处理

取5 g样品于50mL比色管，加入10mL乙酸铵的流动相漩涡混合1min，超声30min，用甲醇定容至刻度线，摇匀，静置，取上层清液用0.22μm微孔有机系滤膜过滤于进样品瓶中待上机检测。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的选择

有研究表明曲酸在二元混合提取溶剂中比单一的提取试剂提取效率高，而过氧化苯甲酰在国标中则要求加碘试剂，按国标中加碘试剂之后，230 nm的检测下会出现一个很大的吸收峰，会对检测形成一定的干扰。经试验，用甲醇和水的混合提取液浸泡也能提取过氧化苯甲酰并使其水解成苯甲酸，并且回收率也能达到满意的效果。

曲酸在流动相pH≥7时，色谱峰拖尾很严重，然而在pH＜7时，色谱峰拖尾明显改善，在pH＜6时不再有明显变化，根据这一现象，考虑曲酸在不同pH的提取液时，效果是否不同，经试验，把水相调节在pH分别为3、4、5和纯水时，曲酸其回收率分别为99.3%、99.5%、100.9%、99.6%，苯甲酸其回收率分别为99.2%、99.2%、100.8%、99.6%，由此可见回收率在pH等于5时相对提高一些，所以提取液水相选择乙酸铵流动相。

2.2 检测波长的选择

曲酸和苯甲酸的紫外吸收不同，根据2种组分的紫外吸收图谱（见图1和图2），选择230 nm和270 nm分别检测，发现曲酸在270 nm下检测，其响应值并未比在230 nm下检测提高很多，而且在270 nm检测时，杂质的出峰也比在230 nm时响应更高（图4），所以最终检测波长定为230 nm。曲酸和苯甲酸标准物质色谱图见图3。

图1 曲酸的紫外吸收谱图Fig.1 UV absorption spectra of kojic acid

图2 苯甲酸的紫外吸收谱图Fig.2 UV absorption spectra of benzoyl peroxide

图3 曲酸（1）和苯甲酸（2）标准色谱图Fig.3 Typical HPLC chromatograms of kojic acid（1）and benzoyl peroxide（2）

2.3 线性范围、标准曲线和检出限

曲酸在1.0μg/mL～50μg/mL内线性良好，线性方程为：y=1.876 151 7×107x-1.619 526×104，相关系数为0.999 8；根据信噪比（RSN=3）计算，仪器检出限为0.1μg/m L，样品检出限为1.0μg/g，过氧化苯甲酰在0.5μg/mL～25μg/mL内线性良好，线性方程为：y= 7.169 433×107x-2.357 799×103，相关系数为0.999 9；根据信噪比（RSN=3）计算，仪器检出限为0.05μg/mL，样品检出限为0.5μg/mL。

2.4 回收率和精密度

在空白样品中添加5、10μg/g的曲酸和2.5、5μg/g的过氧化苯甲酰进行加标回收试验，由表2可见，曲酸的回收率范围为98.8%～99.7%，相对标准偏均差小于0.5%；过氧化苯甲酰的回收率范围为97.2%～99.4%，相对标准偏均差小于1%。

表2 曲酸空白样品加标回收率（n=6）Table2 Recoveries of kojic acid in blank sample（n=6）

2.5 样品检测结果

按照本方法对25个面粉样品进行分析，均未检测出曲酸和过氧化苯甲酰，图4为空白样品色谱图、图5为典型样品加标后的色谱图。从图5中可以看出，样品中的曲酸和苯甲酸很好的被分离，且无干扰峰。

3 结论

图4 空白样品的色谱图Fig.4 Chromatograms of blank sample

图5 样品加标色谱图（曲酸（1）和苯甲酸（2）加标量分别为10μg/g，5μg/g）Fig.5 Chromatograms of quality control with kojic acid（10μg/g）and benzoyl peroxide（5μg/g）

在本方法确定的前处理及色谱条件下，样品的曲酸平均回收率为99.28%，RSD<0.5%，过氧化苯甲酰平均回收率为98.74%，RSD<1%。曲酸回收率稳定在98.8%～99.7%之间，过氧化苯甲酰回收率稳定在97.2%～99.4%之间，曲酸和过氧化苯甲酰稳定性良好。本方法具有灵敏度高、损失小回收率高的特点，适合面粉中曲酸和过氧化苯甲酰的快速检测。

[1] 顾娟红,杨天宇.曲酸的安全性及检测方法研究进展[J].理化检验,2012(2):125-127

[2] 赵新河,李枚秋,钟秋平.曲酸及其衍生物的研究进展[J].中国酿造,2007(10):4-7

[3]黄娟,刘艳,丁涛.高效液相色谱-串联质谱法测定食品中曲酸[J].色谱,2012(6):578-583

[4]刘彦芳,姚晨之,王佩维.化妆品及原料中有害物质的分析研究进展[J].中国日用化学工业研讨会,2007:97-103

[5]孙微,陶文沂.曲酸在食品添加剂中的应用[J].食品与发酵工业, 1997(1):69-72

[6]李伟,赵全年,宋卫东.过氧化苯甲酰毒性的研究进展.疾病监测与控制[J],2010(7):391-392

[7]朱文杰,茅力,王建,等.面粉中过氧化苯甲酰检验方法的研究进展[J].环境卫生学杂志,2012(2):194-199

[8] 陈菲.比色法测定曲酸霜中曲酸的含量[J].中国现代应用药学, 1997(4):52-53

[9]路纯明.过氧化苯甲酰的测定与应用研究[J].分析科学学报, 1999(5):402-405

[10]中国检验检疫科学研究院.SN/T 1499-2004《化妆品中曲酸的检测方法液相色谱法》[S].北京:中国标准出版社,2005:1-6

[11]国家粮食局谷物油脂化学研究所,国家粮油质量监督检验中心. GB/T 22325-2008《小麦粉中过氧化苯甲酰的测定高效液相色谱法》[S].北京:中国标准出版社,2001:1-7

Detection of Kojic Acid and Benzoyl Peroxide of Wheat Flour by HPLC

YAN Long，ZHANG Xue-zhong，TAN Jian-lin*，NIU Zhi-rui，REN Xin-jun，FENG Lei
（Yunnan Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Kunming650223，Yunnan，China）

An analytical method based on high performance liquid chromatography（HPLC）was developed for the determination of kojic acid and benzoyl peroxide of wheat flour.Sample preparation involved extraction using water，the extraction was fixed volume with methanol.Kojic acid and benzoyl peroxide was separated on a C18 column using gradient elution with a mobile phase of 0.02mol/L ammonium acetate/methanol solution at the flow rate of 1.0mL/min，the HPLC-PDA chromatogram of analytes was recorded at230 nm and 270 nm.The results showed that kojic acid（R2=0.999 7，in the range of1μg/mL-50μg/mL）and benzoyl peroxide（R2=0.999 9，in the range of0.5μg/mL-25μg/mL）showed good linearity over the concentration range.The recovery and limit of determination（LOD）varied from 98.8 to 99.7%，from 97.2 to99.4%，1.0μg/g and 0.5μg/g，respectively. This method had used for kojic acid and benzoyl peroxide in wheat flour to its simple and reliable.

wheat flour；kojic acid；benzoyl peroxide；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.029

2013-11-08

晏龙（1988—），男（汉），大专，研究方向：食品中非法添加剂的检测。

*通信作者：谭建林（1985—），男（汉），硕士研究生。