金钱草总黄酮的抗炎活性

金钱草总黄酮的抗炎活性

阎婷李益生

(辽宁医学院，辽宁锦州121001)

摘要〔〕目的探讨金钱草总黄酮提取物的体外抗炎活性。方法通过分析金钱草总黄酮提取物对5-脂氧酶(5-LOX)的抑制作用以及对T细胞的增殖抑制作用，检测金钱草总黄酮提取物抗炎作用。结果金钱草总黄酮提取物可明显抑制脂氧酶的活性，并具有一定的T细胞增殖抑制活性。结论金钱草总黄酮提取物具有良好的抗炎活性，其临床应用的潜力巨大。

关键词〔〕金钱草；总黄酮；抗炎；5-脂氧酶

中图分类号〔〕R932〔文献标识码〕A〔

基金项目：2012年辽宁医学院青年科技启动

第一作者：阎婷(1981-)，女，讲师，博士在读，主要从事天然药物活性成分研究。

金钱草为报春花科珍珠菜属植物过路黄的干燥全草，味苦、酸、微寒，归肝、胆、肾、膀胱经，始载于《本草纲目拾遗》〔1〕。临床报道具有清热解毒，利尿排石，活血散淤的作用，用于肝、胆结石，胆囊炎，黄疸性肝炎，泌尿系结石，水肿，跌打损伤；外用治化脓性炎症，烧烫伤〔2〕。对于该药的现代药理学研究多有开展，但是多集中于该药的临床排石，抑菌及镇痛等作用〔3〕；而对于金钱草总黄酮提取物抗炎的作用，均为动物体内实验活性〔4〕，其分子机制还未见报道。本文探讨金钱草总黄酮提取物的抗炎活性。

1材料与方法

1.1试剂与动物5-脂氧酶(5-LOX)(Sigma公司)；辣根过氧化物酶(HRP，上海雪满生物科技有限公司)；花生四烯酸(AA)、TMPD、Tris(Amresco公司)；实验采用昆明小鼠为药理样本(辽宁医学院实验动物中心)。

1.2仪器Flustar微板多功能测定仪(德国BMG公司)；DHZ-D冷冻恒温震荡器(江苏太仓市试验设备厂)；MH-1型微量振荡器(江苏海门其林贝尔仪器制造)；QL-901漩涡振荡器(江苏海门麒麟仪器厂)；SZM F124 Ice Maker (SANYO公司)；Milli-Q Plus超纯水装置(美国Millipore公司)；PH计(梅特勒-托利多上海有限公司)；96孔细胞培养板(美国Costar公司)。

1.3金钱草总黄酮提取金钱草药材加8倍量50%乙醇超声提取3次，每次45 min，过滤，滤液经石油醚萃取3次，取水相，浓缩，采用NKA-9型大孔吸附树脂进行纯化，以20 mg/ml浓度上样，6倍量水洗涤，50%乙醇洗脱后得到金钱草总黄酮提取液，冷冻干燥得金钱草总黄酮粉末。

1.4金钱草总黄酮对5-LOX的抑制作用AA先被5-LOX催化生成5-羟基过氧四烯酸，经辣根过氧化酶(HPR)以5-羟基过氧四烯酸和TMPD为底物作用生成600 nm处有吸收的物质。96孔板分别加入空白组、对照组和实验组，每组均设置6个复孔。空白组中每孔加入Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)190 μl和10 μl的HPR；对照组每孔加170 μl的 Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)、10 μl的5-LOX(700 U/孔)和20 μl的HPR(700 μg/ml)；实验组每孔中加入160 μl的Tris-HCl(0.1 mol/L，pH7.0)、10 μl的总黄酮提取物、10 μl的5-LOX(700 U/孔)和20 μl的HPR 700 μg/ml。轻轻振摇96孔板混匀溶液，37℃孵育10 min。加样孔中加入10 μl的TMPD(2.8 mg/ml)。加样孔中再加入10 μl的AA。轻轻振摇96孔板混匀溶液，25℃孵育。酶标仪设置600 nm处读取OD值。金钱草总黄酮浓度设置高、中、低三个剂量，分别为1、0.1、0.01 mg/ml。

1.5金钱草总黄酮对小鼠T细胞的增殖抑制作用托颈处死小鼠，75%酒精浸泡1 min，超净台上解剖取出脾脏，去除结缔组织后PBS漂洗。置于装有完全DMEM培养基(10%胎牛血清和1%双抗)的一次性平皿中，无菌注射器将脾脏一端扎几个小孔后，注射器吸取完全DMEM培养基从脾脏另一端扎入并将脾脏内细胞吹出，反复几次。淋巴细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃去上清后加红细胞裂解液重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，反复几次直至红细胞全部裂解。台盼蓝染色计数活细胞。配制2×109个/L的淋巴细胞悬液，96孔板中每孔加入100 μl淋巴细胞悬液和10 μl的待测药物，5%CO2、37℃孵育60 min，再加入10 μl的Con A(终浓度为10 μg/ml)，同上条件孵育48 h。每孔均加入MTT(浓度5 mg/ml)10 μl，同上条件孵育4 h后，去掉上清，加入DMSO 100 μl，微量震荡后酶标仪检测570 nm的OD值。药物浓度分别1 000、100、10、1、0.1 μg/ml。抑制率%=1-OD加药/OD对照。

1.6统计学分析采用SPSS17.0进行单因素方差分析。

2结果

2.1金钱草总黄酮对5-LOX的抑制作用0.01、0.1、1 mol/ml的金钱草总黄酮对5-LOX的抑制率分别为2.5%、53.7%及70.5%。

2.2金钱草总黄酮对小鼠T细胞的增殖抑制作用见表1。在总黄酮浓度为0.1 mg/ml时，金钱草总黄酮呈现了微弱的抑

表1　金钱草总黄酮对T细胞增殖的抑制作用 ± s)

与对照组比较：1)P<0.05

制趋势，而随着浓度的上升，其抑制能力也显著上升，当总浓度达到10 mg/ml时，体系的抑制效率同对照组相比呈现了明显的差异，表明金钱草总黄酮有明显抗炎活性。

3讨论

临床上对于该药的利用多为排石，如方剂中的复方金钱草颗粒，胆宁片等〔5，6〕。一般认为金钱草的功效为清热利湿及通淋，其相应的药理作用则可能在于对胆囊的促进及对人体成石率的抑制，并提高患者的肾脏系数。同时，针对尿道感染，金钱草也可起到相应的作用，杨宁宁等〔7〕研究表明，金钱草对于下尿路的感染效果明显优于传统的阿莫西林。但是对于金钱草抗炎的研究，仍然仅针对动物的体外实验，而对机制层面的研究不多。对于其抗炎作用的解释仅仅从传统医学理论中的利湿角度出发〔8〕，但是尚未解释金钱草总黄酮在此过程中的作用。同时，大量的药理研究表明，黄酮类物质拥有良好的抗炎药理学活性〔9〕。而作为金钱草的主要成分，总黄酮与金钱草的种种活性密切相关，但是对于金钱草总黄酮的研究仍然是清除结石〔10〕，而对于其与抗炎活性的相关性研究尚显不足。可以推测，金钱草或其相关成药中的总黄酮，在其抗炎机制中会起到一定的作用。

作为一种长单链蛋白质，5-LOX广泛的存在于动植物的组织中。在人等哺乳动物体内，5-LOX可将AA氧化成5-羟基四烯酸和5-羟基过氧四烯酸(5-HPETE)最终生成白三烯类化合物。同时，导致血管通透性增加、血浆外渗，引起平滑肌尤其是支气管平滑肌收缩，引起支气管哮喘。而本模型的原理则是AA先被5-LOX催化氧化生成5-羟基过氧四烯酸，然后HPR以5-羟基过氧四烯酸和TMPD为底物生成一种物质，并在610 nm处产生吸收。再通过反应液在紫外分光光度计下吸收值的不同，确定相应提取物对于脂氧酶的抑制作用。本研究则主要测试了金钱草总黄酮的抗炎作用，这与临床报道〔7〕是相符的。但是，该报道仅从金钱草总黄酮的抗菌作用角度出发，而笔者的研究则从分子角度对该结果进行阐述，并由此推论，金钱草的抗感染疗效是抑菌同抗炎相结合的双重作用的结果。特别是金钱草中的黄酮，在抗炎的过程中发挥了巨大的作用。

金钱草可以有效地抑制脂氧酶活性，并产生了显著的抗炎作用，为进一步验证该结果，进行了抑制小鼠体外T淋巴细胞抗炎的实验。淋巴细胞是人体内的主要免疫细胞，而其中的T细胞拥有细胞免疫功能，然而其过度的增殖，则会介导某些自身免疫性疾病，如风湿性关节炎、斑秃及系统性红斑狼疮等。同时，在风湿性关节炎的病理环节中，T细胞也起到了重要的作用〔11〕。同时，在正常及病理性应答条件下，T细胞的活化在免疫应答中有着关键的作用〔12〕。基于此，本结果表明，金钱草总黄酮对小鼠的T细胞有着特异性的抑制作用，特异性的抑制T细胞的活化程度，可以对风湿性关节炎等免疫系统疾病起到明显的治疗作用，且对各种过敏性疾病也可以起到防治作用。

本文通过对金钱草总黄酮提取物的细胞药理分析发现，金钱草总黄酮可以有效地抑制5-LOX的活性，并抑制小鼠体外T细胞的增殖，体系体现出显著的抗炎作用。然而，由于中药的复杂性，特别是复方的综合作用，金钱草的抗炎作用不仅仅是总黄酮的单一作用，其他的单体成分也会对其抗炎产生协同作用。本文从黄酮类化合物的抗炎特性出发，确定了金钱草总黄酮抗炎活性的物质基础及代谢机制，为临床用药及进一步的研究提供了新的思路，而对其全面的抗炎活性，需综合临床效果及其他药理模型进一步确认。

4参考文献

1国家药典委员会 编.中华人民共和国药典.2010年版.〔S〕.一部.北京：中国医药科技出版社，2010：204.

2徐昊.金钱草及其伪品的鉴别〔J〕.实用中医药杂志，2012；28(9)：797.

3王浴生，邓文龙，薛春生.中药药理与应用〔M〕.北京：人民卫生出版社，1998:695-703.

4顾丽贞，张百舜，南继红，等.四川大金钱草与广金钱草抗炎作用的研究〔J〕.中药通报，1988；13(7)：40-2.

5周军，韦桂宁，吴超伟，等.复方金钱草颗粒对肾结石的影响及其利尿，解痉，抗炎作用〔J〕.中国实验方剂学，2011；17(18)：206-9.

6向阳，项建斌，马保金，等.胆宁片对胆石症患者胆汁成分和成石趋势的影响〔J〕.上海医学，2008；31(2)：104-6.

7杨宁宁，管敏昌，彭苍骄，等.金钱草颗粒治疗急性下尿路感染疗效观察 〔J〕.现代中西医结合杂志，2011；20(21)：2629-30.

8郭建生，张猛，曾贵荣，等.湿热颗粒抗炎止痒的实验研究 〔J〕.湖南中医药大学学报，2011；31(1)：40-2.

9钟艳梅，冯毅凡.毛茛属药用植物中黄酮和内酯类成分的研究进展 〔J〕.中草药，2011；42(4)：825-8.

10邹志辉，崔维奇，谌辉鹏，等.金钱草黄酮提取物对大鼠肾脏草酸钙结石形成的影响 〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013；19(4)：195-9.

11Yocum DE.The role of T-cells in rheumatoid arthritis and the use of immunomodulating drugs 〔J〕.Drugs Today，1999；35(4-5)：295-307.

12Favero J，Lafont V.Effector pathways regulating T cell activation 〔J〕.Biochem Pharmacol，1998；56(12)：1539-47.

〔2014-06-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)