广西壮族长寿群体白细胞端粒长度与TERC基因变异的相关性

广西壮族长寿群体白细胞端粒长度与TERC基因变异的相关性

黎海燕1罗晓秋刘承武王艺苑吴华裕2葛琳彭均华潘尚领

(广西医科大学病理生理学教研室，广西南宁530021)

摘要〔〕目的探讨广西壮族长寿群体白细胞端粒长度与端粒酶基因hTERC多态性的相关性。方法采用TaqMan MGB探针检测广西壮族长寿群体TERC基因位点(rs12696304、rs16847897和rs3772190)多态性，并与其第一代子女组及同地区普通人群即对照相比较，同时分析其与白细胞端粒长度(LTL)的相关性。结果(1)rs12696304、rs16847897及rs3772190的基因型频率在三个组间的分布无差异，P值分别为0.83、0.33和1.00；等位基因频率在三个组间也是相似的，P值分别为0.70、0.83和0.98；三个位点的最小等位基因分别是C、G和G。(2)TERC基因三个位点的不同基因型之间的LTL在总人群、长寿组及子女组均无明显差异，对照组在位点rs3772190，GA基因型LTL最长，其次为GG基因型，AA基因型LTL最短，P=0.02。(3)建立LTL的多元线性回归方程，总人群中显示LTL与年龄是明显相关的，但与TERC基因位点的各基因型并不相关。结论TERC基因多态性对广西壮族长寿群体LTL无明显影响。

关键词〔〕端粒酶基因；端粒长度；长寿

中图分类号〔〕R339.36〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81360066)，广西自然科学

通讯作者：潘尚领(1965-)，男，博士，教授，主要从事衰老与长寿遗传学研究。

1南宁输血医学研究所

2广西医科大学细胞生物学与遗传学教研室

第一作者：黎海燕(1978-)，女，在读博士，助理研究员，主要从事衰老与长寿遗传学及输血研究。

Study on the association between leukocyte telomere length and genetic variants on TERC gene of Guangxi Zhuang longevity population

LI Hai-Yan, LUO Xiao-Qiu, LIU Cheng-Wu,etal.

Department of Pathophysiology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the potential relationship between polymorphism of TERC and leukocyte telomere length(LTL) in Guangxi Zhuang longevity population.MethodsGenotyping of TERC SNPs (rs12696304, rs16847897and rs3772190) were performed with TaqMan MGB for the members from longevity population (longevity group, n=485), and their polymorphism were compared with their offspring population (offspring group, n=627), and controls without a familial history of exceptional longevity in the same area(control group, n=218); at the same time the possible association between TERC genotypes and LTL in three groups were evaluated.Results(1) Genotypic frequencies of SNP rs12696304 , rs16847897 and rs3772190 between the three groups were similar (P=0.83, 0.33 and 1.00, respectively); the allelic frequencies among the three groups also showed no significant difference (P=0.70, 0.83 and 0.98, respectively); the minor alleles were C, G and G. (2) Between different genotypes of three loci of TERC, LTL showed no difference among the three groups; but in control group, the LTL of G carriers of rs3772190 (GG/GA) was significantly longer than AA genotype carriers. (3) Multiple linear regression analysis showed that LTL significantly correlated with age, but not with the genotypes of three TERC loci.ConclusionsThere is no obvious correlation between TERC polymorphism and LTL in Guangxi Zhuang longevity population.

【Key words】TERC; Telomere length; Longevity

端粒酶是一种特殊的核蛋白反转录酶复合体，负责端粒DNA重复序列的再合成，确保端粒的正常修复和端粒长度(TL)的维持，由端粒酶RNA元件(hTERC)、端粒酶反转录酶(hTERT)及端粒酶相关蛋白等组成〔1〕。端粒酶活性主要取决于这两个亚单位，其中hTERC为非编码的RNA，在端粒合成时提供模板序列，hTERT为125 kD的单链多肽，在端粒合成时起催化作用〔2〕。端粒与衰老关系密切，TL随年龄增加而逐渐缩短在许多研究中已经得到证实〔3,4〕，近年已逐步成为人类衰老重要的生物学标记之一。端粒酶是TL的主要调控因素之一，那么端粒酶基因的突变是否会影响TL？本课题组的前期研究发现白细胞TL(LTL)在壮族长寿群体中有一定的遗传倾向〔5〕。本研究拟通过对广西壮族长寿群体的端粒酶TERC基因常见变异的三个多态位点(rs12696304、rs16847897和rs3772190)进行基因型检测，了解三个组间这些位点的基因型及等位基因的频率分布情况，并分析其与LTL的相关性，以探讨TERC基因多态性对LTL的影响。

1材料与方法

1.1研究对象及标本的采集长寿组主要为广西地区(包括东兰、凤山、都安、巴马及平果县)的壮族≥90岁的长寿老人，共485人，其中男117人，女368人，平均年龄(93.17±3.02)岁；子女组为长寿老人的第一个子或女，共627人，其中男477人，女150人，平均年龄(57.75±7.80)岁；对照组为同地区的普通人群，其家族史中没出现过≥90岁的老人，且与长寿老人无任何的血缘关系，共218人，其中男121人，女97人，平均年龄(64.63±10.15)岁。根据“知情同意”原则采集研究人群的血样，用经典苯酚/氯仿法提取基因组DNA。所有对象在采样前均接受问诊及体格检查及认知、自理能力的测试，基本排除糖尿病、心脑血管病变及老年痴呆等相关疾病。

1.2研究方法

1.2.1LTL的测定采用实时荧光定量PCR对外周血白细胞相对TL进行测定，端粒的引物：上游：5′ ACACTAAGGTTTG GGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT3′，下游：5′TGTTAGGTAT CCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA 3′；内参36B4基因的引物：上游：5′CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 3′，下游：5′ CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA 3′，具体方法参照文献〔5〕。

1.2.2TERC基因三个位点基因型的检测针对TERC基因三个位点rs12696304、rs16847897及rs3772190的核酸序列设计TaqMan探针，采用FAM及VIC荧光标记的两种报告基团，聚合酶链反应(PCR)体系包含：TaqMan Universal PCR Master Mix 5 μl、引物/探针0.7 μl、DNA 1 μl、ddH2O 3.3 μl，总反应体积10 μl。扩增条件：预变性95℃ 10 min；变性92℃ 15 s，退火60℃ 1 min，共40个循环。用ABI 7500 Real Time PCR System分析检测结果。随机抽取所有样品的5%进行重复检验作为质控，空白对照以双蒸水代替样本DNA，余成份相同。

1.3统计学方法采用PASW Statistics 18.0软件，采用拟合优度分析研究对象的Hardy-Weinberg平衡，χ2检验比较基因型及等位基因的频率。经检验LTL基本呈正态分布，采用协方差分析消除年龄的影响比较各组不同性别或基因型之间的LTL，多元线性回归建立影响LTL各因素的回归方程。

2结果

2.1H-W平衡检验经拟合优度分析，TERC基因位点rs12696304、rs16847897和rs3772190均符合H-W平衡(P>0.05)，因此样本具有一定的群体代表性。

2.2不同分层下各组的LTL情况总体上三个组间LTL的比较并无显著性差异，性别分层后，同性别三个组间LTL的比较亦无显著性差异，同一组内不同性别间LTL的比较，显示对照组中女性LTL长于男性，P=0.01，而该趋势在长寿组及子女组中并不存在，P分别为0.71和0.07。见表1。

2.3组间基因型及等位基因频率的比较位点rs12696304、rs16847897及rs3772190的基因型频率在三个组之间分布相似，P值分别为0.83、0.33和1.00；等位基因频率在三个组间也无显著性差异，P值分别为0.70、0.83和0.98；三个位点最小等位基因分别为C、G和G。见表2。

表1　不同分层下各组的

表2　三个组间基因型及等位基因频率的比较〔 n(%)〕

表3　rs12696304位点TERC基因型对LTL的影响 ± s)

表4　rs16847897位点TERC基因型对LTL的影响 ± s)

表5　rs3772190位点TERC基因型对LTL的影响 ± s)

2.4TERC基因型对LTL的影响见表3~表5。以年龄为协变量，用协方差分析比较各组不同基因型之间的LTL。总人群、长寿组及子女组显示TERC基因的每个检测位点的基因型之间的LTL无区别。对照组在位点rs3772190 GA基因型LTL最长，其次为GG基因型，AA基因型LTL最短，P值为0.02。

2.5基因型与LTL的线性关系对年龄及各基因型建立LTL的多元线性回归方程，年龄与LTL有明显的回归关系，未标准化系数(β)为-0.003，P值为0.000，但TERC位点各基因型与LTL未存在线性关系。见表6。

表6　总人群LTL与各影响因素的线性相关性

3讨论

TL与衰老关系密切，一般的规律是年龄越大TL越短，它们之间是负相关的关系，本研究结果显示，广西壮族群体LTL与年龄也呈现明显的负相关，支持了这个观点。编码hTERC的基因位于3q26.3〔6〕，TERC基因常见多态性位点为rs3772190、rs12696304、rs10936599及rs16847897等〔4,7〕。文献报道，TERC基因突变可以导致TL的缩短，Shen等〔8〕研究结果表明：在中国汉族人群中TERC基因的多态性位点rs12696304和rs16847897与LTL呈明显相关性，rs12696304(G)和rs16847897(C)的个体具有相对较短的LTL。很多疾病如骨髓造血障碍、先天角化不良等被发现与TERC基因突变及TL的缩短相关联〔9〕，Sheng等〔10〕用GWAS确定TL与TERC位点(rs12696304和rs16847897)有关联，与第一四分位数(最短)的TL相比，第二和第三个四分位数的TL可能发生急性淋巴细胞性白血病的风险较低，此外，与CC基因型比较，rs16847897 CG基因型患急性淋巴细胞性白血病的风险率增加29%。长寿与TL和TERC基因突变也有一定的相关性，Soerensen等〔4〕研究发现丹麦人中rs3772190(A)及rs12696304(G)的男性其LTL较短，而与长寿有关的位点是rs3772190。但是，也有TL与TERC基因多态性并不相关的报道：Maubaret等〔11〕发现TERC基因rs12696304 G、rs10936601 T和rs16847897 C组成的单倍型GTC与低风险的冠心病和Ⅱ型糖尿病患病率是相关的，但该单倍型对LTL并无影响。

广西壮族自治区长寿老人较多，特别是巴马县及其所在的红水河流域包括东兰、凤山、都安等县的长寿老人众多，是著名的长寿之乡〔12〕。本文中对这些地区及周边的平果县长寿群体进行LTL的测定，推测，长寿群体及其子女理论上应该是LTL较长，而对照组LTL较短，而结果显示，LTL在三个组间并无差异，区分性别后LTL在三个组间的比较亦无差异，仅在组内比较时发现对照组女性LTL长于男性，表明长寿组虽然年纪较大，但其LTL仍与其子女或周围的普通老年人相当，因此探讨TERC基因的多态性是否可以解释长寿老人较长LTL的机制。

在不同民族和地区间，TERC等位基因频率差异很大，Prescott等〔13〕报道英国和加拿大的群体，rs12696304最小等位基因为G，频率分别为0.26和0.27，rs16847897最小等位基因为C，频率分别为0.26和0.28，rs3772190最小等位基因为A，频率为0.25，并发现rs16847897最小等位基因C与LTL的对数成负相关的关系。中国汉族报道rs12696304和rs16847897 MAF分别是C(0.32)、G(0.39)〔9〕，和本研究的广西壮族群体频率相近。在位点rs3772190中，G等位基因携带者LTL较长，AA基因型LTL最短，因此，该位点在对照组G>A的变异可能为不利变异。LTL与年龄相关联，这个结果和Benetos等〔14〕的报道是一致。

综上所述，本研究考虑除TL的变化对衰老的影响外，长寿的获得可能还有其他因素的影响。总之，长寿是一个复杂的表型，TL的使用给我们提供了一个研究老年疾病的新维度〔14〕，其更深的机制有待进一步的研究。

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10Sheng X，Zhang L，Luo D，etal.A common variant near TERC and telomere length are associated with susceptibility to childhood acute lymphoblastic leukemia in Chinese〔J〕.Leuk Lymphoma，2012;53(9)：1688-92.

11Maubaret CG，Salpea KD，Romanoski CE，etal.Association of TERC and OBFC1 haplotypes with mean leukocyte telomere length and risk for coronary heart disease〔J〕.PLoS One，2013;8(12)：e83122.

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13Prescott J，Kraft P，Chasman DI，etal.Genome-wide association study of relative telomere length〔J〕.PLoS One，2011;6(5):019635.

14Benetos A，Okuda K，Lajemi M，etal.Telomere length as an indicator of biological aging：the gender effect and relation with pulse pressure and pulse wave velocity〔J〕.Hypertension，2001;37(2 Pt 2)：381-5.

〔2014-07-04修回〕

(编辑袁左鸣)