不同剂量沙美特罗替卡松联合川芎嗪对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺组织炎症的影响

不同剂量沙美特罗替卡松联合川芎嗪对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺组织炎症的影响

金明哲熊瑛1

(重庆医科大学附属永川医院呼吸内科，重庆402160)

摘要〔〕目的 探讨ICS/LABA联合川芎嗪对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺部炎症的干预作用。方法70只Wistar大鼠随机分为对照组(A组)、模型组(B组)、川芎嗪组(C组)、中剂量ICS/LABA组(D组)、中剂量ICS/LABA联合川芎嗪组(E组)、高剂量ICS/LABA组(F组)、高剂量ICS/LABA联合川芎嗪组(G组)，每组10只。采用烟熏加气管内注入脂多糖(LPS)法建立COPD模型。吸入ICS/LABA中、高2个剂量及川芎嗪腹腔注射进行干预。观察大鼠肺功能及肺组织病理变化，流式细胞术测定血中CD4、CD8值，酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺泡灌洗液(BALF)中转化生长因子β1(TGF-β1)表达，免疫组化法测定肺组织中金属基质蛋白酶-9(MMP-9)、分泌性白细胞蛋白酶抑制物(SLPI)的表达，RT-PCR法检测肺组织中MMP-9 mRNA的表达。结果B组大鼠肺泡壁破坏，肺大疱形成，间质内大量炎性细胞浸润，符合COPD肺组织病理改变，各干预组均有所减轻；B组大鼠MMP-9及其mRNA相对含量、TGF-β1浓度比A组大鼠显著升高；CD4/CD8比A组大鼠明显降低。经ICS/LABA及川芎嗪干预后，各组大鼠MMP-9及其mRNA相对含量、TGF-β1浓度与B组大鼠相比有明显降低(P<0.05)；CD4/CD8、SLPI比B组大鼠有显著提高(P<0.05)，以G组疗效最明显(P<0.05)。相关分析表明，MMP-9与第0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)/用力肺活量(FVC)呈负相关(r=0.861 3，P<0.01)；SLPI与FEV0.3/FVC呈正相关(r=0.832 1，P<0.01)。结论ICS/LABA和川芎嗪均可抑制COPD大鼠肺部炎症，高剂量ICS优于低剂量ICS，且联合用药比单独用药疗效显著，其机制可能是通过降低TGF-β1、MMP-9水平并调节SLPI及CD4、CD8的表达而实现。

关键词〔〕阻塞性肺疾病；转化生长因子β1；金属基质蛋白酶9；分泌性白细胞蛋白酶抑制物

中图分类号〔〕R563.3〔文献标识码〕A〔

通讯作者：熊瑛(1954-)，女，教授，硕士生导师，主要从事哮喘及慢性阻塞性肺疾病研究。

1泸州医学院附属医院呼吸一科

第一作者：金明哲(1988-)，男，硕士，主要从事慢性阻塞性肺疾病研究。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是严重影响人类健康的多发病之一，炎症是其发病的核心机制，香烟及感染等有害刺激导致中性粒细胞、肺泡巨噬细胞等炎性细胞在气道局部聚集，促进转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶(MMP-9)等炎症介质和细胞因子的释放，并构成复杂的网络系统〔1〕，使肺部大量炎症细胞聚集、浸润；并降低机体免疫能力及分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)的表达，使肺组织损伤与修复交替出现，最终引起肺组织破坏及纤维化。GOLD建议以高剂量吸入性糖皮质激素(ICS)联合长效B2受体激动剂(LABA)为最佳方案，但长期大剂量应用ICS副作用大，炎症控制不理想。研究发现〔2〕，川芎嗪能抑制肺部炎性细胞的聚集、氧自由基的释放，并可促进炎症吸收，减轻肺部损害。ICS/LABA联用川芎嗪对COPD肺部炎症是否具有更好的调控作用，目前这方面的实验研究还未见报道。本研究观察不同剂量的ICS/LABA及联用川芎嗪对COPD大鼠肺功能、肺组织中TGF-β1、MMP-9、SLPI及CD4/CD8表达改变，初步探讨其对COPD动物模型肺部炎症的调控作用。

1材料与方法

1.1动物模型复制SPF级健康雄性Wistar大鼠70只，平均体重(160±20)g(重庆鑫腾生物公司)。随机分为对照组(A组)、模型组(B组)、川芎嗪组(C组)、中剂量ICS/LABA组(D组)、中剂量ICS/LABA联合川芎嗪组(E组)、高剂量ICS/LABA组(F组)、高剂量ICS/LABA联合川芎嗪组(G组)，每组10只。天下秀牌香烟(川渝中烟工业有限公司，焦油量10 mg，烟气烟碱量0.8 mg)；LPS(美国，Sigma公司)；TGF-β1试剂盒(美国R&D公司)；ICS/LABA(舒利迭50 μg/250 μg、50 μg/500 μg，葛兰素史克公司)；川芎嗪注射液(河南辅仁怀庆堂制药有限公司)；动物肺功能仪(美国 Buxco公司)；SLPI抗体(美国 Bioworld Technology公司)；MMP-9抗体(北京博奥森公司)；Trizol RNA 提取试剂盒(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒 (美国MBI公司)。参照文献〔3，4〕等所用方法复制动物模型，有所改良：B组大鼠在实验第1、14天，向气管内注入LPS(200 μg/200 μl)。分别在实验第2～13天、第15～45天，将大鼠放入容积为60 L的自制密闭玻璃染毒箱(30 cm×40 cm×50 cm)内被动吸烟，方法为：将点燃的香烟通过玻璃孔将烟雾注入烟熏箱内，2次/d，每次15支，持续1 h，间隔4 h/组。各干预组造模方法同B组，于第16～45天烟熏前1 h开始干预，1次/d；C组以川芎嗪腹腔注射(80 mg/kg)；D组以舒利迭(50 μg/250 μg)滴鼻；E组以川芎嗪(80 mg/kg)腹腔注射、舒利迭(50 μg/250 μg)滴鼻；F组以舒利迭(50 μg/500 μg)滴鼻；G组以川芎嗪(80 mg/kg)腹腔注射、舒利迭(50 μg/500 μg)滴鼻；各组滴鼻方法为，舒利迭两喷溶于1.7 ml生理盐水+0.3 ml聚山梨酯-80，0.3 ml/只，2次/d，据文献〔5〕，此剂量和成人每天1 mg相符；A组：各干预因素均以相同剂量生理盐水代替，玻璃箱内吸入空气。

1.2大鼠肺功能测定实验第46天，以2%的戊巴比妥钠(25 mg/kg)麻醉大鼠，气管插管，放入体描箱，应用动物肺功能检测仪〔6〕，测定呼气峰流量(PEF)、第0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)、FEV0.3/用力肺活量(FVC)。

1.3CD4、CD8数值的检测剪开大鼠腹壁皮肤，暴露腹主动脉，以无菌采血器穿刺腹主动脉取血2 ml，装入4 ml BD抗凝管内。摇匀后用流式细胞仪检测血中CD4、CD8值。

1.4肺泡灌洗液(BALF)TGF-β1的检测以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)进行右心室灌注，打开胸腔后夹闭右肺，以3 ml生理盐水灌洗左肺，反复3次，总回收量约为7 ml，回收率为75%~80%。所回收的BALF采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TGF-β1浓度，按照说明书操作。

1.5肺组织标本和形态定量分析取右肺中叶，多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色；取右肺上叶，修剪成0.5 cm厚的块状，生理盐水冲洗两遍后，迅速放于液氮中。肺组织用2%四氧化锇固定，切片，醋酸铀-柠檬酸铅电子染色，应用图像处理系统，测量肺平均内衬间隔(MLI)、肺泡破坏指数(DI)。

1.6肺组织SLPI和MMP-9检测采用10%多聚甲醛固定各组大鼠右肺中叶，石蜡切片，常规脱蜡脱水，按MMP-9、SLPI免疫组化检测试剂盒说明书操作，抗体浓度均为1∶100。每只大鼠取2张切片，应用HPIAS-1000病理图文分析系统检测每张切片10个视野的阳性系数。阳性系数的计算参见文献〔7〕。

1.7RT-PCR法测定大鼠肺组织MMP-9 mRNA表达取肺组织标本30 mg，按照Trizol RNA提取试剂盒说明提取总RNA，逆转录成cDNA。以SYBR Green Ⅰ作为荧光标志物，应用荧光实时定量PCR仪进行PCR反应。根据GenBank的cDNA序列设计引物，以β-actin为内参照物(上海生工生物工程技术服务有限公司)。MMP-9正义引物：5'-CATCTGGGGATTGAACTCAG-3',反义引物：5'-GTGGTGTCCTCCGATGTAAG-3',扩增长度为235 bp。β-actin正义引物：5'-CCTAGACTTCGAGCAAGAGA-3',反义引物：5'-AGAGGTCTTTACGGATGTCA-3',扩增长度为221 bp。通过融解曲线和电泳结果确定目的条带并分析，△△Ct法进行目的基因的相对定量。

2结果

2.1一般情况及组织病理学观察B组大鼠均精神萎靡，少食，体毛干枯发黄，咳嗽及呼吸急促、口唇及四肢发绀、仰卧位呼吸，各干预组有不同程度好转，制作模型时共死亡10只。光镜下，A组肺组织无异常改变；B组大鼠各级支气管明显狭窄，气道上皮复层化，杯状上皮细胞增生，间质内有大量炎性细胞浸润，肺泡壁破坏，肺泡腔扩大，部分破裂融合成肺大疱。干预组肺泡壁破坏程度和肺大疱数目较B组均有所减轻，炎性细胞浸润减少。见图1。

2.2大鼠肺功能与肺组织形态学结果与A组相比，B组大鼠PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC显著降低，MLI和DI明显增高(P<0.05)。各干预组大鼠PEF、FEV0.3及FEV0.3/FVC均明显高于B组，MLI和DI显著低于B组(均P<0.05)；干预组组间比较，G组变化明显P<0.05)。见表1。

2.3大鼠血清CD4/CD8比较B组大鼠血清CD4/CD8的含量明显低于A组(P<0.05)；各干预组CD4/CD8值明显高于B组(P<0.05)。干预组组间比较，G组变化明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1　各组大鼠肺组织光镜下形态观察(HE，×100)

2.4BALF中TGF-β1表达水平B组TGF-β1浓度明显高于A组(P<0.05)；各干预组TGF-β1浓度明显低于B组(P<0.05)；干预组组间比较，G组变化明显(P<0.05)。见表2。

2.5SLPI在大鼠肺组织的免疫组化表达SLPI在气管、支气管上皮细胞免疫染色呈强阳性，仅在细胞质和管腔侧细胞膜着色(图2)。A组SLPI呈现强阳性表达；B组为弱阳性表达，两组差异有统计学意义(P<0.05)；各干预组与B组相比，SLPI表达明显增强，各组阳性系数与B组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；干预组组间比较，G组变化明显(P<0.05)。见表2。

表1　大鼠肺功能与形态分析比较 ± s)

与A组比较：1)P<0.05；与B组比较：2)P<0.05；与G组比较：3)P<0.05；下表同

表2　大鼠血清CD4/CD8、BALF中TGF-β 1浓度、肺组织SLPI、MMP-9阳性系数及MMP-9 mRNA 相对含量的比较

图2　各组大鼠SLPI的表达(DAB，×400)

2.6MMP-9在大鼠肺组织的免疫组化表达MMP-9在支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、等免疫染色呈强阳性，以胞质染色为主(图3)。B组MMP-9强阳性表达；A组表达MMP-9呈弱阳性表达，两组差异有统计学意义(P<0.05)；各干预组MMP-9呈中度阳性表达，与B组相比差异均有统计学意义(P<0.05)；干预组组间比较，G组变化明显(P<0.05)。见表2。

图3　各组大鼠MMP-9的表达(DAB，×400)

2.7大鼠肺组织中MMP-9 mRNA的表达与A组比较，B组大鼠肺组织中MMP-9 mRNA表达量明显增高(P<0.05)；各干预组大鼠支气管肺组织中MMP-9 mRNA表达量明显比B组降低(P<0.05)；干预组组间比较，G组变化明显(P<0.05)。见表2。

3讨论

吸烟和反复呼吸道感染等导致的炎性介质与细胞因子瀑布可直接损伤气道和肺组织，促使蛋白酶/抗蛋白酶、氧化/抗氧化失衡，从而使COPD气道炎症迁延不愈。本研究结果显示，模型组大鼠出现咳嗽、呼吸急促、口唇及四肢发绀，肺功能FEV0.3/FVC明显降低，光镜下肺组织出现明显炎症浸润、肺泡间隔断裂、肺泡腔扩大、部分融合为肺大疱，MLI和DI显著增加，说明动物模型复制成功〔8〕。

COPD是一种慢性炎症性疾病，TGF-β1在其发病中起着重要作用，不仅促使成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，增加纤维黏蛋白和胶原的合成，并抑制胶原酶和蛋白酶的产生以减少胶原降解，导致气道炎症及纤维化，同时作为强效免疫抑制因子〔9〕，能抑制T/B淋巴细胞的增殖及免疫球蛋白的分泌，降低免疫水平，加重肺组织炎症；此外TGF-β1可通过活化细胞内真核蛋白激酶信号途径和上调转录因子Ets-1刺激足突细胞MMP-9 mRNA表达增加，MMP-9作为蛋白水解酶，可破坏肺泡基质成分，促使大量炎性细胞穿透基底膜屏障进入肺组织，释放炎性因子，加重蛋白酶/抗蛋白酶失衡，使肺部炎症呈联级式爆发；同时TGF-β1还通过Smads信号通路抑制SLPI的表达和分泌〔10〕，SLPI作为气道内最重要的保护基质，具有抗蛋白酶、抗炎、抗真菌活性，可抑制MMP-9的产生，减轻气道炎症；还能降低气道中弹性蛋白酶水平，进而中断炎症循环；研究发现〔11〕,无论在急性发作期还是稳定期，COPD患者肺泡灌洗液中CD4/CD8水平都呈下降状态，导致免疫功能低下，进而加重COPD肺部炎症反应。本研究结果与相关报道相一致〔12〕，提示炎性细胞因子在COPD肺部炎症的发生、发展中起重要作用。

舒利迭是丙酸氟替卡松和沙美特罗的复方制剂，分别作用于气道炎症的不同环节，可抑制多种炎性细胞的活化及炎性因子的生成；并能增强纤毛的清除能力，减轻气道高反应性。在某些环节上更具有协同作用，ICS能减少β2受体的脱敏和耐药性;而LABA可将糖皮质激素受体磷酸化,使受体对类固醇的刺激更敏感,进而增强抗炎效能。而川芎嗪可减轻气道黏膜水肿，利于分泌物排出；能降低肺动脉压和肺毛细血管内压，减轻右心后负荷，改善机体缺氧状态；还可提高超氧化物歧化酶含量，增强清除自由基的作用；同时可阻止免疫复合物的形成，抑制病原菌生长，促进炎症吸收。

本研究结果说明在抑制COPD肺部炎症方面，ICS/LABA联合川芎嗪的疗效优于单一用药，对减少肺组织的破坏，改善肺功能，调节肺部TGF-β1、MMP-9、SLPI的表达和分泌及增强机体免疫能力等方面均有较满意的效果，这就提示，不管在COPD急性发作应用高剂量ICS/LABA，还是稳定期降阶梯应用中剂量ICS/LABA时，均可联合应用川芎嗪治疗，对增强机体免疫、保护肺功能、减少急性发作频率和入院率，延缓COPD的发展可能具有更好的效果。

参考文献4

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10牛瑞超，罗百灵，冯俊涛，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠支气管肺组织分泌性白细胞蛋白酶抑制物表达及转化生长因子β1的影响〔J〕.中华结核与呼吸杂志，2007；30(11)：851-6.

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12Theodore AO，Mark DE，Alexis R，etal.Matrix metalloproteinase-9 predicts pulmonary status declines in α1-antitrypsin deficiency〔J〕.Respir Res，2011;12(1):35.

〔2013-09-12修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

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