三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

董晓华张成龙吴志刚沈丽霞张丹参1孟宪勇2

(河北北方学院药理教研室，河北张家口075000)

摘要〔〕目的研究三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤后学习记忆障碍的影响。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、三七皂苷R1 1.4 mg/kg组 (R1A组)和三七皂苷R1 7.0 mg/kg组(R1B组)。大鼠腹腔注射三七皂苷R1，连续给药14 d，实验第4天制作右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，缺血后2 h再灌。再灌后不同时间点采用Longa法对大鼠进行神经功能行为缺陷评分，采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法记录大鼠脑梗死体积，Morris水迷宫法观察大鼠空间学习记忆能力，电生理学方法记录中枢突触传递长时程增强(LTP)现象。结果三七皂苷R1(1.4，7.0 mg/kg)可减少大鼠脑梗死体积，改善大鼠空间学习记忆障碍，增强大鼠海马齿状回高频刺激(HFS)诱导的LTP现象。结论三七皂苷R1对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

关键词〔〕三七皂苷R1；脑缺血再灌注；学习记忆；长时程增强

中图分类号〔〕R964〔文献标识码〕A〔

基金项目：河北省教育厅重点课题(ZD2014065)；张家口市科技局资助课题(0291098D)；河北北方学院自然科学研究计划项目(2009033)

通讯作者：孟宪勇(1976-)，男，副主任医师，硕士，硕士生导师，主要从事生物工程与神经干细胞研究。

1河北科技大学2河北北方学院附属第一医院骨外科

第一作者：董晓华(1976-)，女，副教授，博士，主要从事神经药理学研究。

三七具有活血化淤、消肿止痛、抗衰老、抗肿瘤等作用，广泛用于中药方剂〔1〕。三七主要单体成分为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，目前人们对人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1研究较多，证明它们具有改善学习记忆、抗氧化、抗应激、抗衰老、抗组织缺血等作用。然而对三七皂苷R1的药理作用研究报道较少，作为三七独有的活性成分是否与其他主要活性成分一样具有改善学习记忆等脑保护作用，有待进一步深入研究。本实验观察三七皂苷R1对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积、空间学习记忆障碍、海马齿状回(DG)高频刺激(HFS)诱导的长时程增强(LTP) 现象的影响。

1材料与方法

1.1动物、主要试剂及仪器健康雄性SD大鼠，体重180~200 g，购自中国医学科学院动物繁育厂。三七皂苷R1，南京泽朗医药技术有限公司。VC-11记忆示波器SEN-7203三道电子刺激器(日本Nihon Konden)，SS-202J刺激隔离器(日本Nihon Konden)，江湾Ⅰ型-C脑立体定位仪，LTP生物信号采集处理系统2003，Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。

1.2分组及给药SD大鼠随机分成4组，每组8只，假手术组，模型组，三七皂苷R1 1.4 mg/kg组(R1A组)，三七皂苷R1 7.0 mg/kg组(R1B组)。从实验第1天起动物每天腹腔注射不同剂量三七皂苷R1，连续给药14 d，模型组和假手术组注射等体积的生理盐水。实验第4天给药后，参照相关文献，腔内线栓法制备右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，缺血后2 h再灌，假手术组不插入栓子，其余操作相同。

1.3脑缺血再灌注大鼠模型制备〔2〕10%水合氯醛(300 mg/kg，腹腔注射)麻醉动物后，仰卧位固定于手术台上，分离右侧颈总、颈外和颈内动脉，结扎颈外动脉远心端，动脉夹夹闭颈总动脉近心端，在颈外动脉靠近颈内、外分叉约5 mm处剪一小切口，拉直颈内和颈外动脉成一条直线，插入栓线至大脑中动脉主干的起始部，固定栓线，松开颈总动脉。2 h后提拉栓线退至颈外动脉，实现大脑中动脉再灌注。

1.4神经功能行为缺陷评分大鼠缺血再灌注后12、24、48和72 h按Longa法5分制评分标准进行神经功能行为缺陷评分，术后评1～3分者为手术成功标志。0分：未观察到神经功能缺陷症状；1分：不能完全伸展手术对侧前肢(轻度局灶性神经功能缺陷)；2分：向手术对侧转圈(中度局灶性神经功能缺陷)；3分：行走时向手术对侧倾倒(重度神经功能缺陷)；4分：不能自行行走，意识昏迷。

1.5脑梗死体积测定造模后24 h，处死大鼠，快速断头取脑，切除嗅脑、小脑和低位脑干后，取冠状面从前向后连续等距离切取5个脑片，将脑片放于2%TTC染液37℃孵育30 min，4%多聚甲醛避光固定24 h。正常脑组织呈红色，梗死组织呈白色，将白色组织仔细分离并称重，按以下公式计算脑梗死体积：脑梗死体积百分比=缺血部分重量/全脑重量×100%。

1.6Morris水迷宫实验Morris水迷宫实验于第10~14天进行，包括第10~13天训练实验和第14天测试实验。训练实验中，每天训练4次，间隔3 min，每次训练120 s〔3〕，训练时大鼠从4个不同象限面朝池壁放置，记录动物找到站台的时间(逃避潜伏期)。如果动物在120 s未能找到站台，将其放置在站台上20 s。训练实验后24 h移走站台，进行测试实验，测试时间是120 s，记录大鼠在目标象限(训练时站台所在的象限)停留的时间和穿过站台的次数〔4〕。

1.7电生理学实验给药14 d后1 h行电生理学实验。20%氨基甲酸乙酯(1.5 g/kg，腹腔注射)麻醉大鼠，固定于立体定位仪上。参照Pellegrino大鼠脑立体定位图谱，埋植双极刺激电极于内嗅区前穿通纤维(PP)，记录电极于DG颗粒细胞层。诱发电位，HFS参数，数据分析处理等方法见文献〔2〕。如果群峰电位(PS)幅度较自身对照值增加30%以上且持续时间超过30 min，则表明LTP现象已形成。

1.8统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2结果

2.1神经功能行为缺陷评分术后12、24、48、72 h各组大鼠Longa评分结果见表1。各组组内不同时间点比较，均在24 h时Longa评分最高，然后逐渐下降；同一时间不同组间比较，模型组4个时间点Longa评分均高于假手术组(P<0.01)；三七皂苷R1组4个时间点Longa评分均低于模型组(P<0.05或P<0.01)。

表1　三七皂苷R1对脑缺血再灌注大鼠神经功能行为

与假手术组比较：1)P<0.01 ；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2脑梗死体积测定大鼠脑缺血再灌注24 h脑梗死体积见图1。假手术组未见梗死灶，模型组和三七皂苷R1各组均出现梗死灶，梗死区主要位于右侧大脑顶叶皮质和纹状体外侧白质区；模型组脑梗死体积(41%)高于假手术组(0%，P<0.01)；R1A组(22%)与R1B组(8%)与模型组比较，脑梗死体积减小(P<0.05；P<0.01)。

2.3Morris水迷宫实验随着训练天数的增加，各实验组潜伏期均不断缩短；第1天各组间潜伏期相比无差异(P>0.05)；模型组与假手术组相比，训练第2天开始，潜伏期延长(P<0.05;P<0.01)；三七皂苷R1组与模型组相比，从第2天开始，潜伏期明显缩短，(P<0.05；P<0.01)。在第5天的测试实验中，模型组大鼠目标象限搜寻时间百分率和穿过平台次数减少(P<0.01)，而三七皂苷R1组显著增加(P<0.05或P<0.01)。见表2。

A：假手术组；B：模型组；C：R1A组；D：R1B组 图1　三七皂苷R1对脑缺血再灌注大鼠脑梗死 体积的影响

2.4电生理学实验各组在给予HFS后，PS幅值在观察的60 min内均明显增加，并形成LTP现象，但每组HFS后PS幅值增长的幅度不同；与假手术组相比，模型组在HFS后60 min内各时间点PS幅值减少(P<0.01)；三七皂苷R1组较模型组PS幅值在高频刺激后的每个时间点都明显升高。HFS后60 min内的平均PS幅值显示，模型组较假手术组降低(P<0.01)；三七皂苷R1组较模型组平均PS幅值升高(P<0.05；P<0.01)。见表3。

表2　三七皂苷R1对脑缺血再灌注大鼠空间学习记忆能力的影响 ± s， n=8)

与假手术组比较：1)P<0.01，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

表3　三七皂苷R1对脑缺血再灌注大鼠海马HFS刺激后不同时间点PS幅值的影响 ± s， n=8，%)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01

3讨论

脑缺血再灌注损伤的病理生理机制极为复杂，主要与自由基过度形成、兴奋性氨基酸毒性作用、细胞内钙超载、炎性反应等有关，同时伴有神经功能受损、学习记忆障碍和脑梗死灶形成等。祖国传统医药在治疗缺血性脑血管病方面有较大潜力，越来越多的植物药在脑缺血再灌注损伤中得到研究和应用，尤其是中药单体的生物活性研究，易于阐明确切药理作用和机制，同时通过对多种单体的构效关系研究也易于发现活性较强化合物。本研究选择三七皂苷 R1进行药效学实验，能够促进三七新生物活性的发现和药用价值的评定。已有研究证实三七皂苷R1具有抑制血栓形成，抗氧化、改善微循环等作用，也有体外实验证实三七皂苷R1对过氧化氢所致的大鼠海马神经元损伤具有保护作用〔5〕，但对于学习记忆的影响未见报道。

本实验结果表明三七皂苷R1对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用，且可改善缺血再灌注大鼠空间学习记忆障碍。海马是学习记忆过程中起关键作用的中枢结构，LTP是海马突触可塑性的重要形式，是学习记忆的神经细胞学基础〔6〕。本实验证实三七皂苷R1(1.4，7.0 mg/kg)对脑缺血再灌注大鼠海马齿状回HFS诱导的LTP有增强作用，即从细胞水平证实三七皂苷R1对脑缺血再灌注损伤引起的学习记忆障碍有改善作用。

参考文献4

1唐娇,黄俊明,张印红,等.三七的药理活性及毒理学研究进展〔J〕.毒理学杂志,2012;26(3):228-31.

2董晓华,张丹参,张力,等.蛇床子素对脑缺血/再灌注大鼠海马LTP及氨基酸含量的影响〔J〕.中国药理学通报,2011;27(9):1267-71.

3Rich NJ，Van Landingham JW，Figueiroa S，etal.Chronic caloric restriction reduces tissue damage and improves spatial memory in a rat model of traumatic brain injury〔J〕.J Neurosci Res，2010;88(13):2933-9.

4Zhang WW，Sun QX，Liu YH，etal.Chronic administration of Liu Wei Dihuang protects rat's brain against D-galactose-induced impairment of cholinergic system〔J〕.Acta Physiol Sin，2011;63(3)：245-55.

5次向明,张秋颖,王忠,等.黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1对过氧化氢所致大鼠海马神经元损伤的保护作用〔J〕.中国中医基础医学杂志,2004;10(6):34-6.

6Cooke SF，Bliss TV.Plasticity in the human central nervous system〔J〕.Brain,2006;129(7):1659-73.

〔2013-06-08修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)