SK-7041对血管紧张素Ⅱ致大鼠心肌细胞肥大的干预作用

SK-7041对血管紧张素Ⅱ致大鼠心肌细胞肥大的干预作用

陆莹肖刚1任鹏蒋桂华王新春

(哈尔滨医科大学附属第二医院急诊科，黑龙江哈尔滨150086)

摘要〔〕目的探讨SK-7041在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌细胞肥大过程中的抑制作用。方法常规方法培养大鼠原代心肌细胞，分为3组：对照组、肥大组、SK-7041组。利用AngⅡ刺激心肌细胞造成肥大模型，并给予SK-7041进行干预。反转录聚合酶链反应观察β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达；相差显微镜和电镜观察心肌细胞的表面积和超微结构变化；免疫组织化学法检测c-fos蛋白的表达。结果大鼠原代心肌细胞在AngⅡ作用下表面积增加，超微结构发生改变；β-MHC mRNA和c-fos蛋白表达增加(P<0.05)。给予SK-7041干预后，上述变化显著缓解(P<0.05)。结论SK-7041可抑制AngⅡ刺激引起的心肌细胞肥大，为临床上治疗心肌肥厚提供一条新的思路。

关键词〔〕SK-7041；血管紧张素Ⅱ；心肌细胞；肥大

中图分类号〔〕R542.2〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511303)

通讯作者：肖刚(1971-)，男，副主任医师，硕士，主要从事心肌病发病机制的研究。

1解放军第二一一医院医务处

第一作者：陆莹(1971-)，女，副主任医师，博士，主要从事心肌病发病机制的研究。

临床上多种心血管疾病都伴有心肌肥大，如冠心病、高血压性心脏病、风湿性心脏病等等，但是对于心肌肥大的原因尚未完全明确。近年来研究表明，在心肌细胞肥大的信号传导通路中，组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)发挥着重要作用〔1〕，其中Ⅰ类HDACs对于心肌肥大有一定的促进作用〔2，3〕，因此对于其抑制剂的研究逐渐受到学者们的重视〔4〕。3-(4-取代苯基)-N-羟基-2-丙烯酰胺(SK-7041)作为新型Ⅰ类HDACs抑制剂，主要作用于Ⅰ类HDACs 中的HDAC1、HDAC2，目前仅被用于肿瘤性疾病的研究〔5〕，其在心血管疾病方面的作用尚未被研究。因此，本课题组以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激心肌细胞造成肥大，给予SK-7041进行干预，以观察SK-7041对于心肌细胞肥大的抑制作用。

1材料与方法

1.1材料出生后1～3 d清洁级Wistar乳鼠，由哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK(黑)20020017。SK-7041(In2Gen/SK，Sigma公司)。DAB 显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。DMEM(美国Hyclone公司)。RT-PCR试剂盒(TakaRa公司)。RT-PCR引物由北京奥科公司合成。免疫组化SABC试剂盒(博士德公司)。兔抗大鼠c-fos多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology Inc.USA)。

1.2心肌细胞培养和分组取出心脏后，剪成4～5块，0.25% 胰酶反复消化、吸取上清，2 000 r/min离心10 min。加入含10% 胎牛血清的DMEM高糖培养液，将细胞重悬并计数。按细胞数106/ml或107/ml将细胞接种于培养板或培养瓶中。心肌细胞分为对照组、肥大组和SK-7041组。96 h后换无血清培养液，同时SK-7041组加入SK-7041，继续培养1 h后肥大组和SK-7041组加入AngⅡ，使SK-7041终浓度为10-6mol/L，AngⅡ终浓度为2×10-7mol/L。37℃、5%CO2培养。加入AngⅡ后12 h和24 h进行以下检测。

1.3相差显微镜观察心肌细胞面积变化加入AngⅡ后12 h和24 h于相差显微镜下观察细胞形态，各组均随机选取10个视野，每个视野随机选取10个心肌细胞，在1 600倍下应用Motic Images1.3软件测量心肌细胞面积，计算平均值。

1.4电镜观察细胞形态变化胰酶消化细胞，用PBS液洗2次，2.5 %戊二醛固定，常规方法脱水、包埋、制作超薄切片、染色，在透射电镜下观察。

1.5反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA表达按照试剂盒说明书进行操作。β-MHC基因引物序列：上游：5'-ACC AAG CAG CCA CGC CAG TA-3'；下游：5'-TGC TTT GCC TTT GCC CTT GT-3'；扩增片段长度为596 bp。β-actin基因引物序列：上游：5'-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3'；下游：5'-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG-3'；扩增片段长度为764 bp。以β-actin为内参照，结果以β-MHC/β-actin比值表示。各组样本数为10例。

1.6免疫组化法检测c-fos蛋白表达冷丙酮固定各组心肌细胞20 min，置于0.3% H2O2中30 min抑制内源性过氧化物酶。加入一抗4℃过夜。加入二抗，室温下2 h。DAB显色。苏木素复染。乙醇脱水，二甲苯脱乙醇，封片。镜下观察，c-fos以细胞质黄染为阳性。采用镜下随机选取10个视野，分别计算c-fos表达阳性心肌细胞的百分数。

2结果

2.1SK-7041对心肌细胞表面积的影响在1 600倍镜下，对照组、SK-7041组心肌细胞面积在12、24 h点均低于肥大组(P<0.05)；但SK-7041组心肌细胞面积仍高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2电镜结果对照组可见心肌细胞内细胞核偏于一侧，呈梭形；细胞内肌丝排列整齐，粗面内质网、游离核蛋白体丰富。肥大组可见心肌细胞体积较大，肌丝排列紊乱，线粒体内膜髓鞘样变；高尔基体、内质网及扁平囊崩解。SK-7041组可见肥大的心肌细胞胞质内含有大量的溶酶体，质膜下粗面内质网扩张尤为明显，细胞表面有质膜叶片伸出，细胞核膜下有轻度染色质的边集。

2.3SK-7041对心肌细胞β-MHC mRNA表达的影响对照组、SK-7041组心肌细胞β-MHC mRNA表达在12、24 h点均低于肥大组(P<0.05)；但SK-7041组仍高于对照组(P<0.05)。见表2。

表1　各组心肌细胞面积比较

与对照组比较：1)P<0.05；与肥大组比较：2)P<0.05；下表同

表2　各组心肌细胞β-MHC mRNA表达比较

2.4SK-7041对心肌细胞c-fos蛋白表达的影响对照组、SK-7041组心肌细胞c-fos蛋白表达在12、24 h点均低于肥大组(P<0.05)；但SK-7041组仍高于对照组(P<0.05)，见表3。

表3　各组心肌细胞c-fos蛋白阳性表达比较

3讨论

近年来，分子遗传学、单细胞和器官生理学的进展使得对涉及心肌肥大的各信号通路的研究日新月异，大量以基因工程技术处理过的动物模型使人们能够在分子水平上探索各个不同的信号途径及其交汇联系，并发现了许多在心肌肥大和心功能衰竭过程中起重要作用的信号通路。心肌细胞肥大是临床多种心血管疾病所伴有的一种病理性改变，探讨其发生的病理生理机制，对于治疗有重要意义。AngⅡ、去甲肾上腺素等多种化学刺激亦可造成心肌细胞肥大，同时伴有c-fos、c-jun、c-myc等原癌基因表达迅速加强，并促使蛋白质合成增加，诱导心肌肥大。本文表明，在AngⅡ诱导的体外心肌细胞肥大模型中，心肌细胞表面积、c-fos蛋白和β-MHC基因的表达均增加，并出现了超微结构的改变；给予SK-7041后减少了肥大心肌细胞的表面积，同时也降低了这一过程中的β-MHC mRNA和c-fos蛋白表达，从而证实了SK-7041对心肌细胞肥大的抑制作用。这一结果与其抑制特异性抑制Ⅰ类HDACs的作用相关。

目前认为，心肌细胞核心组蛋白的乙酰化/去乙酰化与基因调控密切相关，催化组蛋白乙酰化的酶是组蛋白乙酰基转移酶(HATs)，而催化组蛋白去乙酰化的酶是HDACs，二者作用相反。HDACs可通过移去组蛋白H3、H4赖氨酸残基上的乙酰基，使带正电荷的赖氨酸残基暴露，后者与DNA之间的相互作用可限制核小体在DNA之间的移动，进而阻碍了作为基本转录单位的蛋白质复合物进入启动子结合位点。由此可见，HDACs通过对组蛋白去乙酰化，可使DNA结构更加紧密，从而抑制某些基因的转录。HDACs分为三类，其中Ⅰ类HDACs中的HDAC1、2被认为可促进心肌细胞肥大，而Ⅱ类HDACs可抑制心肌细胞肥大〔6~8〕。

SK-7041作为一种新型的Ⅰ类HDACs抑制剂，与其他非特异性HDACs抑制剂(如TSA、丙戊酸)相比，可特异性抑制Ⅰ类HDACs 中的HDAC1/2复合物。目前主要被应用于研究肿瘤性疾病〔9〕，尚未见于心肌细胞肥大的研究。本实验结果证实了推测：SK-7041可有效抑制心肌细胞肥大，进一步说明HDAC1/2对于心肌肥大的促进作用，同时希望能够为心肌肥大的发病机制研究提供一条新的思路。

参考文献4

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2Kee HJ,Kook H.Roles and targets of class Ⅰ and Ⅱa histone deacetylases in cardiac hypertrophy〔J〕.J Biomed Biotech，2011;2011:928326.

3Hamamori Y，Schneider.HATs off to hop：recruitment of a class I histone deacetylase incriminates a novel transcriptional pathway that opposes cardiac hypertrophy〔J〕.J Clin Invest，2003；112(6)：824-6.

4Cao DJ，Wang ZV，Battiprolu PK，etal.Histone deacetylase (HDAC) inhibitors attenuate cardiac hypertrophy by suppressing autophagy〔J〕.Proc Natl Acad Sci，2011；108(10)：4123-8.

5Lee KW，Kim JH，Park JH，etal.Antitumor activity of SK-7041，a novel histone deacetylase inhibitor，in human lung and breast cancer cells〔J〕.Anticancer Res，2006； 26(5A)：3429-38.

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8Trivedi CM，Luo Y，Yin Z，etal.Hdac2 regulates the cardiac hypertrophic response by modulating Gsk3 beta activity〔J〕.Nat Med，2007；13(3)：324-31.

9Lane AA，Chabner BA.Histone deacetylase inhibitors in cancer therapy〔J〕.J Clin Oncol，2009；27(32)：5459-68.

〔2013-09-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)