慢性乙肝携带者HBV DNA载量与细胞免疫功能间关系研究



慢性乙肝携带者HBV DNA载量与细胞免疫功能间关系研究

张韬，张丽娟，张跃新

(新疆医科大学第一附属医院感染科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐830054)

【摘要】目的:探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者的HBV-DNA载量与细胞免疫功能的关系。方法:选择本院诊治的HBV携带者为观察组(90例)，根据荧光定量PCR法测定HBV-DNA含量分为阴性组(14例)、低拷贝组(49例)、高拷贝组(27例)，同期体检合格的健康人群为对照组(90例)，观察各组受试者外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+百分比和CD4+/CD8+值，外周血B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)、活化T细胞比例，及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1阳性率和PD-1平均荧光强度。结果:观察组患者CD3+、CD4+百分比、CD4+/CD8+值、NK细胞比例均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，CD8+百分比、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1阳性率和PD-1平均荧光强度高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。随着HBV-DNA病毒拷贝数的增加，CD3+、CD4+百分比、CD4+/CD8+值、NK细胞比例降低(P＜0.05或P＜0.01)，CD8+百分比、CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1阳性率及PD-1平均荧光强度上升(P＜0.05或P＜0.01)。结论:慢性乙型肝炎病毒携带者的HBV-DNA病毒载量与外周紊乱的T淋巴细胞之间存在密切联系，临床可动态监测HBV-DNA病毒载量与T淋巴细胞的变化，以指导临床治疗。

【关键词】乙型肝炎病毒;病毒载量;细胞免疫; T细胞亚群;自然杀伤细胞

乙型肝炎病毒(HBV)是一种非细胞毒性的嗜肝病毒，HBV感染可逐渐发展为慢性肝炎，引起严重的肝脏组织的纤维化和硬化，最终发展为肝硬化甚至肝癌，严重威胁着人类的生命健康［1-2］。机体细胞功能紊乱在慢性乙型肝炎的发病中起重要作用，尤其是各种免疫细胞，机体有不同的T淋巴细胞亚群构成，外周T细胞亚群的紊乱可使机体清除HBV能力降低，引起慢性肝脏炎症和细胞损伤［3-4］。HBV-DNA水平是反应病毒在机体内复制的重要指标，为全面了解和认识不同HBV-DNA病毒载量患者的细胞免疫功能的改变，旨在为全面了解HBV感染与肝脏疾病发生发展中细胞免疫功能的改变提供理论依据，现报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选择2013年3月至2014年3月在本院诊治的HBV携带者90例，设为观察组。均符合《病毒性肝炎防治方案》诊断标准和《慢性乙型肝炎防治指南》中HBV携带者的诊断标准［5-6］。排除患有甲、丙、丁、戊型等肝炎，其他病毒感染、结核、自身免疫性肝病、酒精及药物性肝炎及在6个月内接受免疫调节剂和抗病毒治疗的患者。年龄16～70岁，平均(42.3±10.2)岁;病程7个月～11年。根据荧光定量PCR法测定HBV-DNA载量分为阴性组、低拷贝组、高拷贝组，即HBV-DNA拷贝数小于102 copies/mL为阴性组(14例)，HBV-DNA拷贝数小于103～104 copies/mL为低拷贝组(49例)，HBV-DNA拷贝数小于105～108 copies/mL为高拷贝组(27例)。选取同期体检合格的健康人群为对照组(90例)，均无肝炎病史、乙型肝炎标志物测定均阴性。各组受试者性别、年龄等一般资料差异无统计学意义(P＞0.05)。经本院伦理委员会同意，所有患者均知情同意。

1.2方法

受试者入院后于次日清晨空腹抽取静脉血6 mL，分为3管，每管2 mL，其中2管用于分离血清，另1管加入含有40 μL的10％EDTA二钠和抑肽酶1 000 KU/mL的聚丙烯试管，高速低温离心，分离血浆，置于-70℃保存。(1)2 mL血清采用酶联免疫法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb等乙肝标志物，试剂盒购自Abbott公司，严格按照操作说明书进行。(2)2 mL血清用于检测HBV-DNA含量，采用美国ABl5700荧光定量聚合酶链反应检测仪检测，引物均由深圳匹基公司提供。(3)外周T细胞亚群测定采用FACSCalibur流式细胞仪测定，取100 μL的抗凝血于流式专用试管中，加入美国Benton Dinckinson公司提供的CD3+、CD4+、CD19+、CD3+、CD16+或CD56+、活化T细胞(CD3+HLA-DR+)单克隆荧光抗体20 μL。依次进行避光、红细胞溶解、离心等，分别进行淋巴细胞的百分比统计。程序性死亡受体-1-藻红蛋白(PD-1-PE)购自美国eBioscience公司，流式细胞技术测定CD4+和CD8+等淋巴细胞表面PD-1的表达。

1.3观察指标

观察各组受试者外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+百分比和CD4+/CD8+值，外周血B淋巴细胞、NK细胞、活化T细胞比例，及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1阳性率和PD-1平均荧光强度。

1.4统计学分析

统计学分析应用SPSS19.0软件，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，采用t检验分析组间差异，计数资料采用百分率表示，采用χ2检验分析组间差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组受试者外周血T细胞亚群水平比较

观察组患者CD3+，CD4+百分比和CD4+/CD8+值均低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，CD8+百分比高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。随着HBV-DNA病毒拷贝数的增加，CD3+，CD4+百分比和CD4+/CD8+值降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，CD8+百分比升高，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表1。

表1　各组受试者外周血T细胞亚群水平比较(±s)

表1　各组受试者外周血T细胞亚群水平比较(±s)

* P＜0.05，＊＊P＜0.01，与对照组比较; #P＜0.05，##P＜0.01，与DNA阴性组比较;△P＜0.05，△△P＜0.01，与DNA低拷贝组比较。

组别　CD3+(％)　CD4+(％)　CD8+(％)　CD4+/CD8+值对照组(n =90)70.7±14.2　47.6±8.5　26.7±7.2　1.7±0.6观察组(n =90)　65.5±9.1＊＊　35.8±7.4＊＊　32.4±7.9＊＊　1.1±0.3＊＊DNA阴性组(n =14)　69.8±12.3　41.3±7.4*　30.9±7.8*　1.4±0.4 DNA低拷贝组(n =49)　62.4±10.1＊＊#　34.0±5.8＊＊##　35.8±8.1＊＊#　1.0±0.5＊＊##DNA高拷贝组(n =27)　54.4±9.2＊＊##△△　25.8±6.4＊＊##△△　39.7±7.8＊＊##△　0.7±0.4＊＊##△△

2.2各组受试者外周血B淋巴细胞、NK细胞、活化T细胞比例比较

观察组患者NK细胞比例低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，B淋巴细胞、活化T细胞比例与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。随着HBVDNA病毒拷贝数的增加，NK细胞比例下降，差异有统计学意义(P＜0.01)，但B淋巴细胞、活化T细胞的比例差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2　各组受试者外周血B淋巴细胞、NK细胞、活化T细胞比例比较(±s)

表2　各组受试者外周血B淋巴细胞、NK细胞、活化T细胞比例比较(±s)

* P＜0.01，与对照组比较; #P＜0.01，与DNA阴性组比较;△P＜0.01，与DNA低拷贝组比较。

组别　B淋巴细胞(％)　NK细胞(％)　　活化T细胞(％)对照组(n =90)10.3±4.2　18.7±7.2　20.5±9.8观察组(n =90)　10.7±5.1　10.5±4.2*　19.9±8.9 DNA阴性组(n =14)　10.5±4.3　11.2±4.3*　20.1±7.7 DNA低拷贝组(n =49)　10.9±4.1　8.0±3.8* #　20.3±7.9 DNA高拷贝组(n =27)　10.8±5.1　5.8±2.5* #△19.7±5.3

2.3各组受试者外周血T细胞表面PD-1水平比较

观察组患者CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1阳性率和PD-1平均荧光强度高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)。随着HBVDNA病毒拷贝数的增加，CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1阳性率和PD-1平均荧光强度上升，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。见表3。

表3　各组受试者外周血T细胞表面PD-1水平比较(±s)

表3　各组受试者外周血T细胞表面PD-1水平比较(±s)

* P＜0.05，＊＊P＜0.01，与对照组比较; #P＜0.05，##P＜0.01，与DNA阴性组比较;△△P＜0.01，与DNA低拷贝组比较。

组别　CD4+T淋巴细胞PD-1阳性率(％)　PD-1平均荧光强度CD8+T淋巴细胞PD-1阳性率(％)　PD-1平均荧光强度对照组(n =90)12.5±4.3　0.7±0.4　10.3±3.6　0.8±0.4观察组(n =90)　18.3±5.2＊＊　1.9±0.6＊＊　16.9±4.2＊＊　1.7±0.5＊＊DNA阴性组(n =14)　13.5±3.9　1.0±0.6*　12.0±4.1　1.2±0.4＊＊DNA低拷贝组(n =49)　18.7±4.2＊＊##　1.9±0.5＊＊##　16.8±5.1＊＊##　1.7±0.7＊＊#DNA高拷贝组(n =27)　22.3±4.9＊＊##△△　2.8±0.8＊＊##△△　23.5±6.8＊＊##△△　2.4±0.9＊＊##△△

3　讨论

HBV并不能直接损害正常的肝细胞，但HBV感染可诱导机体形成慢性化的感染，机体形成持续性的耐受和激活特异性免疫应答。如果机体免疫功能较强，则可清除病毒，机体得以恢复，表现为急性感染，如果机体免疫功能下降，机体会形成慢性HBV感染，使肝脏发生纤维化和硬化，严重威胁着人类的生命健康［7］。HBV-DNA水平是反应机体HBV感染的指标，其水平高低代表了其复制和感染能力，也代表了机体HBV的病毒载量［8］。正常的外周淋巴细胞群对维持机体正常的免疫功能发挥着重要作用。一旦发生感染，机体的淋巴细胞亚群的数量和功能则会发生紊乱，尤其是T细胞亚群的紊乱使机体不能有效清除HBV，使HBV在机体内持续复制的重要原因，加重慢性乙型肝炎患者的病情［9-10］。

本研究发现，与对照组相比，慢性乙型肝炎病毒携带者的CD3+、CD4+、CD8+的百分比和CD4+/CD8+值差异有统计学意义。CD3+水平下降说明了机体参与免疫应答的免疫活性细胞数量不足，主要是由于慢性乙型肝炎病毒携带者在长期受到HBV感染的情况下，T淋巴细胞发生免疫耐受或启动凋亡程序，T淋巴细胞的激活变为抑制效应［11-12］。CD4+细胞主要在免疫应答中起辅助诱导作用，CD4+水平下降可引起机体细胞免疫功能下降，机体清除HBV的能力下降，加重患者的病情。CD4+/CD8+是反应机体细胞免疫功能的直接指标，当机体免疫功能紊乱时或机体出现一系列的免疫病理改变时CD4+/CD8+往往出现失衡，CD4+/CD8+比值下降主要是由于CD8+细胞增多所致，研究发现在慢性乙型肝炎患者肝脏活检中发现肝小叶坏死区存在大量的CD8+细胞，提示CD8+细胞增多在肝细胞免疫损害中发挥了重要作用［13-14］。进一步研究发现与健康对照组相比，随着HBV-DNA病毒拷贝数的增加，CD3+细胞、CD4+细胞百分比和CD4+/CD8+百分比显著降低。提示随着HBV-DNA复制的增多，机体免疫功能下降更为严重，外周T细胞亚群失衡，进一步增加HBV侵入的机率，机体对HBV清除的能力下降，HBV复制越多，则进一步加剧外周T细胞亚群失衡，二者相互促进。因此临床上可通过抑制HBV复制来改善机体的细胞免疫功能，提高机体对HBV清除的能力。

外周血B淋巴细胞约占总淋巴细胞的10％～15％，可产生具有抗体活性的免疫球蛋白，CD19+是B淋巴细胞的重要标志。NK细胞是自然杀伤细胞，在机体免疫中也发挥了重要作用。本研究发现，慢性乙型肝炎病毒携带者的B淋巴细胞无显著改变，但NK细胞显著下降，且随着HBV-DNA复制的增加，NK细胞下降越严重，这就更加重了机体细胞免疫功能的紊乱，加剧HBV-DNA的感染。叶玲丽等［15］研究发现，与健康对照组相比，慢性乙型肝炎患者的CD4+/CD8+明显下降，NK细胞也显著降低，与HBV-DNA呈负相关，与本研究结果相似。PD-1是近年来发现的负性共刺激信号分子，HBV感染时PD-1和PD-1的配体(PD-L)通路受到限制，T细胞和B细胞的增殖和活化受到抑制，白细胞介素(IL-2、IL-10)和γ干扰素(IFN-γ)分泌也会随之减少。本研究发现，与对照组相比，慢性乙型肝炎病毒携带者的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面的PD-1阳性率和PD-1平均荧光强度显著增加，提示CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞表面高表达PD-1参与了慢性乙型肝炎的发病过程。

综上所述，慢性乙型肝炎病毒携带者的HBVDNA病毒载量与外周紊乱的淋巴细胞之间存在密切联系。提示慢性乙型肝炎病毒携带者存在严重的细胞免疫功能紊乱，HBV-DNA病毒复制活跃加重免疫调节紊乱; HBV感染引起的机体持续性肝脏感染可能是通过多种特异性或非特异性的清除病毒的免疫激活，造成机体免疫功能紊乱。临床可动态监测HBV-DNA病毒载量与T淋巴细胞的变化，以了解患者的机体免疫状态，为临床治疗慢性乙型肝炎提供更好的指导。

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(学术编辑:熊良仕)

Study on correlation between hepatitis B virus DNA loads and cellular immunity in chronic HBV carriers

ZHANG Tao，ZHANG Li-juan，ZHANG Yue-xin

(Department of Infectious Disease，the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University，Urumchi 830054，Xinjiang，China)

【Abstract】Objective: To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV)DNA loads and cellular immunity in chronic HBV carriers.Methods: A total of 90 chronic HBV carriers as observation group assigned to negative group (n =14)，low copy group (n =49)and high copy group (n =27)according to their HBV-DNA load tested by fluorescence quantitative PCR.Another 90 health participants were enrolled as control group.The percentage of CD3+，CD4+and CD8+T lymphocyte，CD4+/CD8+，proportion of B lymphocyte and natural killer (NK)cell in peripheral blood，positive rate and mean fluorescence intensity of PD-1 on surface of CD4+and CD8+T lymphocyte were detected in all groups，respectively.Results: the percentage of CD3+and CD4+T lymphocyte，CD4+/CD8+and proportion of NK cell were significantly lower in observation group than those in control group (P＜0.01)，and the percentage of CD8+lymphocyte，positive rate and mean fluorescence intensity of PD-1 were significantly higher in observation group than those in control group (P＜0.01).The percentage of CD3+and CD4+T lymphocyte，CD4+/CD8+and proportion of NK cell were increased (P＜0.05，P＜0.01)，and the percentage of CD8+lymphocyte，positive rate and mean fluorescence intensity of PD-1 were decreased (P＜0.05，P＜0.01)，with an increase in copy of HBV-DNA increased.Conclusion: There is a potential correlation betweenbook=315,ebook=48HBV-DNA loads and cellular immunity in chronic HBV carriers.Dynamically monitoring on HBV-DNA loads and T lymphocyte can offer valuable reference to clinical treatment.

【Key words】Hepatitis B virus; Viral load; Cellular immunity; T lymphocyte subsets; Natural killer cell

通讯作者:张跃新，E-mail: zhangtao771113@163.com

作者简介:张韬(1977-)，男，新疆库尔勒人，硕士，主治医师，从事肝病/传染病方面临床研究。

基金项目:中国高校医学期刊临床专项资金(11520222)

收稿日期:2015-04-10

doi:10.3969/j.issn.1005-3697.2015.03.10

【文章编号】1005-3697(2015)03-0314-04

【中图分类号】R512.6

【文献标志码】A

网络出版时间: 2015-6-19 17∶39网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20150619.1739.007.html