脊髓继发性损伤大鼠脊髓组织中丙烯醛表达、SOD活性及MDA含量变化

脊髓继发性损伤大鼠脊髓组织中丙烯醛表达、SOD活性及MDA含量变化

张月娥1，许灿1，蔺静1，黄一茜1，张静2

(1保定市第一中心医院，河北保定071000；2河北医科大学附属第三医院)

摘要：目的观察脊髓继发性损伤大鼠脊髓组织中丙烯醛(ACR)表达、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量变化。方法健康雄性SD大鼠48只，随机分为实验组30只、假手术组18只。实验组采用改良Allen′s-WD法制备大鼠脊髓继发性损伤模型，假手术组暴露脊髓后立即缝合。分别于建模后24 h、3 d、7 d处死大鼠，取脊髓组织，HE染色观察脊髓组织病理变化，采用免疫组化法检测脊髓组织中的ACR，采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，硫代巴比妥酸法检测MDA。结果实验组建模后24 h、3 d、7 d脊髓组织中ACR表达量、MDA含量高于相应时点假手术组(P均<0.05)。实验组建模后24 h、3 d、7 d脊髓组织SOD活性低于假手术组(P均<0.01)。结论 大鼠脊髓继发性损伤组织中ACR表达及MDA含量升高，SOD活性降低。

关键词：脊髓损伤；脊髓继发性损伤；丙烯醛；超氧化物歧化酶；丙二醛

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.010

中图分类号：R651.2文献标志码：A

收稿日期：(2015-06-27)

通信作者：张静

氧化应激反应在脊髓继发性损伤的发生和进展中发挥重要作用[1]。研究[2]表明，氧化应激反应产生大量自由基如丙二醛(MDA)，耗竭内源性抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)，破坏内源性抗氧化系统，导致脊髓组织损伤进一步加重。临床清除自由基疗法尚未取得满意效果,有学者推测脊髓继发性损伤后可能有毒性更强、半衰期更长的氧化应激产物如丙烯醛(ACR)等产生，使损伤持续进展。2010年5月~2011年1月，我们观察了大鼠脊髓继发性损伤组织中ACR表达、SOD活性及MDA含量变化，并探讨其意义。

1材料与方法

1.1实验动物与材料SPF级健康雄性SD大鼠48只，体质量240~280 g。兔抗丙烯醛多克隆抗体，PV9003、DAB显色试剂盒，EZ ECL试剂盒，SOD试剂盒及MDA试剂盒，分光光度计，石蜡切片机，低温冰箱，半干电转移槽及垂直电泳槽等。

1.2大鼠脊髓继发性损伤模型建立将48只SD大鼠随机分为实验组30只、假手术组18只。实验组根据改良Allen′s-WD法制作脊髓继发性损伤模型：0.3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉，暴露T11段脊髓，将打击装置整合于立体定位仪上，将一直径3 mm圆形薄金属垫片(3 mm×4 mm，质量0.1 g)置于T11段脊髓表面，以10 g砝码从6.5 cm高度自由坠落打击垫片，造成以T11段为中心的脊髓急性损伤。假手术组暴露脊髓后立即缝合。分别于建模后24 h、3 d、7 d处死大鼠，取原手术切口暴露T10~12段，在冰袋上解剖椎管，取出包括损伤段及损伤阶段上下段脊髓组织(继发性损伤组织)2 cm置于-80 ℃冰箱中保存，留作SOD、MDA检测。取大鼠脊髓组织，浸入4%中性甲醛溶液12~24 h后，留取损伤区及其上下各0.5 cm范围的脊髓组织，以备组织病理学检查及ACR检测。

1.3脊髓组织病理观察将脊髓组织常规切片脱蜡至水，HE染色后于普通显微镜下观察组织形态学变化情况。

1.4脊髓组织中ACR、SOD、MDA检测分别于建模后24 h、3 d、7 d采用免疫组化法检测脊髓组织中的ACR，以阳性细胞染色的平均光密度值代表表达量。采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性。采用硫代巴比妥酸法检测MDA。

1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1脊髓组织病理变化假手术组神经元细胞形态、数量正常。实验组建模后24 h可见局灶性出血，神经元肿胀、变圆、数目减少，神经元核固缩、碎裂，尼氏小体淡染或消失；建模后7 d神经元数目减少，内有空泡形成。

2.2两组脊髓组织中ACR表达、SOD活性、MDA含量比较实验组建模后24 h、3 d、7 d脊髓组织中ACR表达、MDA含量高于相应时点假手术组(P均<0.05)。实验组建模后24 h、3 d、7 d脊髓组织SOD活性低于相应时点假手术组(P均<0.01)。见表1。

表1　 建模后不同时点两组脊髓组织中ACR表达、

SOD活性、MDA含量比较( ± s)

表1　 建模后不同时点两组脊髓组织中ACR表达、

组别nACRSOD活性(U/mgprot)MDA含量(nmol/mgprot)实验组30 建模后24h0.3636±0.0100124.7±8.812.30±1.20 建模后3d0.3462±0.0157137.7±4.811.90±1.14 建模后7d0.3052±0.0162145.9±5.711.01±1.09假手术组18 建模后24h0.1613±0.3910*241.3±12.3#6.34±0.50# 建模后3d0.1762±0.2143*262.6±15.6#6.35±0.64# 建模后7d0.2036±0.2452*255.7±16.4#7.01±0.45#

注：与同时点实验组相比，*P<0.05；与同时点实验组相比，#P<0.01。

3讨论

脊髓继发性损伤发生在原发性损伤后数小时、数天及数周，可导致原发伤周围正常脊髓组织损伤[1]，继发性损伤机制包括缺血再灌注损伤、炎症、氧化应激及谷氨酸等兴奋性氨基酸毒性等[3]。自由基介导的氧化应激反应被认为是引起脊髓继发性损伤的关键因素之一[4]。然而目前现有的清除自由基疗法临床疗效并不满意。

研究[5]表明，丙烯醛的损伤作用机制包括两个方面：其一是作为脂质过氧化反应的诱发者，诱发氧化应激反应进入恶性循环，造成细胞永久损伤；其二是通过与蛋白耦联引起细胞凋亡。有学者[6]建立了体外PC12细胞损伤模型，发现ACR可诱导细胞凋亡，且ACR的细胞毒性较MDA、HNE及其他脂质过氧化产物更强。Due等[7]发现，在大鼠脊髓损伤模型中，ACR表达显著增加，推测其在大鼠运动瘫痪及神经病理性疼痛的发生中可能起重要作用。在豚鼠离体压缩性脊髓损伤模型中，ACR表达在脊髓损伤后4 h开始增高，24 h后达到峰值并能持续1周甚至更长时间，使ACR对脊髓的损伤作用持续存在，而使用其特效清除剂后，神经元细胞膜损伤明显减轻[8]。

MDA也是脂质过氧化反应的代谢产物[9]，可反映细胞受损后氧自由基含量变化及脂质过氧化反应的程度。SOD是超氧自由基的特异性清除酶，能明显减轻自由基介导的脂质过氧化损伤，其活性高低可反映机体抗氧化能力的强弱[10]。在继发性损伤早期，SOD活力值最高，机体内源性抗氧化系统发挥作用；然而，随着ACR表达持续存在，MDA含量逐渐增加，SOD不断耗竭，SOD活性也逐渐降低。研究[11]表明，ACR在神经退行性疾病患者脑组织中水平升高，增强氧化应激水平，引起MDA含量升高，SOD活性下降。

本研究发现，实验组建模后24 h、3 d、7 d脊髓组织中ACR表达量、MDA含量高于相应时点假手术组，SOD活性低于相应时点假手术组。上述结果提示，脊髓损伤后机体内部即产生ACR、MDA，随着ACR、MDA持续生成，SOD活性降低，脊髓损伤持续存在。结合病理观察结果，实验组随建模时间延长，脊髓组织病理变化逐渐加重，进一步表明大鼠脊髓损伤后，体内ACR及自由基大量释放，对神经细胞造成严重破坏。今后我们将研究ACR表达与自由基生成的相关性，寻找相关清除剂以期减轻ACR对脊髓组织的损伤程度。

参考文献：

[1] Park J, Muratori B, Shi R. Acrolein as a novel therapeutic target for motor and sensory deficits in spinal cord injury[J]. Neural Regene Res, 2014,9(7):677-683.

[2] 韩珩,熊敏,余化龙,等.积雪草酸抗氧化应激效应对大鼠急性脊髓损伤的保护作用[J].中华实验外科,2014,31(4):818-820.

[3] Bareyre FM, Schwab ME. Inflammation degeneration and regeneration in the injured spinal cord:insights from DNA microarrays[J]. Trends Neurosci, 2003,26(10):555-563.

[4] 吴碧华,吴文斌,胡常林.自由基与中枢神经系统疾病[J].川北医学院学报,2001,16(4):145-147.

[5] Hamann K, Shi R. Acrolein scavenging:a potential novel mechanism of attenuating oxidative stress following spinal cord injury[J]. J Neurochem, 2009,111(6):1348-1356.

[6] Mizoia M, Yoshidaa M, Saiki R, et al. Distinction between mild cognitive impairment and Alzheimer′s disease by CSF amyloid β40 and β42, and protein-conjugated acrolein[J]. Clin Chim Acta, 2014,430(3):150-155.

[7] Due MR, Park J, Zheng L, et al. Acrolein involvement in sensory and behavioral hypersensitivity following spinal cord injury in the rat[J]. J Neurochem, 2014,128(5):776-786.

[8] Kristin H, Genevieve N, Hui O. Hydralazine inhibits compression and acrolein-mediated injuries in ex vivo spinal cord[J]. J Neurochem, 2008,104(3):708-718.

[9] Hakan T, Toklu HZ, Biber N, et al. Meloxicam exerts neuroprotec-tion on spinal cord trauma in rats[J]. Int J Neurosci, 2011,121(3):142-148.

[10] Liu C, Shi Z, Fan L, et al. Resveratrol improves neuron protection and functional recovery in rat model of spinal cord injury[J]. Brain Res, 2011,1374(2):100-109.

[11] Huang YJ, Jin MH, Pi RB. Acrolein induces Alzheimer′s disease-like pathologies in vitro and in vivo[J]. Toxicol Lett, 2013,217(3):184-191.