北川花魔芋愈伤组织与试管微球茎离体诱导研究

廖 倩， 胡尚连， 曹 颖， 黄 艳， 冯璐璐

（1.西南科技大学生命科学与工程学院， 四川 绵阳621010；2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心， 四川 绵阳621010）

花魔芋（Amorphophallus albus）是栽培面积较广的魔芋品种之一，具有很高的药用和食用价值，其魔芋精粉及衍生物在农业、纺织、建筑、化工等行业得到广泛应用［1－3］。北川花魔芋是四川北川羌族自治县的著名特产，具有与其他地域魔芋产品的不同优异产品特性，获得了农业部颁发的农产品地理标志证书，进入我国农产品地理标志保护行列。北川花魔芋生产上主要依靠半野生种逐步驯化，由于长期连续采挖，野生魔芋资源濒临枯竭［4］。此外，由于缺乏稳定的良种繁育体系，种芋带病且病害逐年加重，种芋的数量和质量已经成为北川花魔芋生产发展的瓶颈［5］。因此，针对北川花魔芋种质资源保存、品种纯化复壮，建立愈伤组织与试管微球茎离体诱导及脱毒繁育体系，对北川花魔芋进一步研究和利用具有重要意义［6－8］。本研究利用组织培养方法，尝试以北川花魔芋的根状茎、嫩叶和叶柄为外植体，建立适合北川花魔芋的愈伤组织诱导和微型试管芋（拟球茎）培养技术，以实现在试管内全年生产种芋，为北川花魔芋良种繁育技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

北川花魔芋采自于四川省绵阳市北川羌族自治县安昌镇幸福村，以2月龄植株的叶柄、嫩叶、叶脉以及根状茎为外植体。

1.2 方 法

1.2.1 外植体处理及接种

将外植体用自来水冲洗2h后，置于超净台上，用75%乙醇消毒30s，用无菌水清洗3～4次，再用0.1%的升汞溶液处理10min，最后用无菌水冲洗3～5次。将消毒后的叶柄切割成薄片（厚度为2～3mm），叶片切割成1cm2左右的方块，根状茎切成约2cm的小段，叶脉切成厚度为2mm左右的长条，将各外植体接种于相应的培养基上。每个处理接种30瓶，叶柄2块／瓶，根状茎4块／瓶，叶脉10块／瓶，叶片20片／瓶；试验重复3次。

1.2.2 不同外植体对愈伤组织诱导的影响

将不同外植体接种于 MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.1 mg／L NAA＋3%蔗糖＋0.8%琼脂培养基中，置于25±1℃黑暗培养，观察愈伤组织诱导情况，30d后统计诱导率。愈伤组织诱导率（%）＝形成愈伤组织的外植体数／接种外植体总数×100%。

1.2.3 不同激素浓度配比对愈伤组织诱导的影响

以MS＋3%蔗糖＋0.8%琼脂为基本培养基，附加不同浓度的6－BA（1.0mg／L 和1.5mg／L）和 NAA（0.1mg／L和0.5mg／L），pH 值为5.8；将接种后的外植体置于（25±1）℃黑暗培养，观察愈伤组织诱导情况，30d后统计诱导率。

1.2.4 继代与分化

外植体培养6周后，选取生长良好的魔芋愈伤组织置于25±1℃、弱光条件下（弱散射光强度约500 lx）进行继代培养，培养基为 MS＋0.5mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA，每30d继代1次。观察并记录愈伤组织变化情况，统计愈伤组织类型比例、增殖系数以及出芽率。增殖频率＝继代过程中发生增殖的愈伤组织所占的比例。

1.2.5 魔芋试管微型芋的诱导

继代培养2～3次后，将愈伤组织切成适当大小的小块，转入 MS＋2.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA＋5%蔗糖培养基中［9］进行试管微球茎诱导试验。

2 结果与分析

2.1 不同外植体类型对愈伤组织诱导的影响

试验中大多数外植体均不同程度诱导出了愈伤组织，但不同外植体愈伤组织形成的时间、形成位置以及愈伤组织质地和颜色等均有较大差异。如图1所示，在 MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L NAA的诱导培养基中，叶柄培养10d后出现卷曲且边缘开始变红（图1a），3周后形成愈伤组织。首先是在切面上会形成许多白色的瘤状小突起，随后瘤状小突起不断变大最后覆盖了整个外植体（图1b），部分叶柄边缘开始变为黑色（图1c）。接种后的叶片增厚膨大，约3周后颜色变淡，边缘切口处变为褐色（图1d）。叶脉接种1周后，体积膨大（图1e），培养2周左右，叶脉切口出现瘤状小突起（图1f），但随后仅极少形成瘤状结构愈伤组织。根状茎在接种后4d左右出现部分变色（图1g），3周之后体积发生膨大，并且部分生长出根状物（图1h），进一步培养后部分根状茎出现粉色或白色的瘤状的愈伤组织，并伴有长满白色毛的根状物（图1i）。从表1中可以看出，不同的外植体形成愈伤组织的能力有明显的不同，从表中可知叶柄外植体（35.0%）和根状茎外植体（32.1%）愈伤组织诱导率明显高于其它类型的外植体。

表1 不同类型外植体的愈伤组织诱导率

2.2 不同激素浓度配比对愈伤组织诱导的影响

由表2可见，不同激素组合对魔芋愈伤组织的诱导效果不一，在相同激素配比下，不同外植体诱导效果出现较大差异。就叶柄而言，各培养基中的愈伤组织诱导率均高于另外2种外植体，其中MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA 诱导效果最好，诱导率为48.3%，诱导率快，愈伤数多；而在该培养基中，叶脉和叶片愈伤诱导率明显偏低，均低于20%；叶片在MS＋1.5mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA 培养基上的愈伤诱导效果较好，然而诱导率仅有16.2%；叶脉在MS＋1.0 mg／L 6－BA＋0.1mg／L NAA培养基上的愈伤诱导效果较好，诱导率为21.7%。

图1 不同外植体在愈伤组织诱导培养基上的培养反应

表2 不同的NAA和BA浓度对魔芋不同外植体愈伤组织诱导的影响

2.3 继代培养过程中愈伤组织类型、增殖频率及其分化能力分析

各种外植体初诱导出的愈伤组织，均结构疏松，而继代2～3次后，愈伤组织会形成3种明显不同的类型（图2，表3）。Ⅰ型为半透明的愈伤组织，没有生长和分化能力，在光照条件下会迅速褐化、坏死（图2a）。Ⅱ型为浅灰褐色、愈伤组织结构疏松状，增殖频率约为63.6%，但不易分化出芽（图2b）。Ⅲ型愈伤组织较白，稍带绿色或者粉色，结构致密、质地坚硬，其表面成球状或瘤状（图2c），该类型的愈伤组织生理状态好，增殖频率较高（90.8%），容易分化出不定芽和微球茎；部分芽直接在愈伤组织上发生，有的则通过拟球茎（其形态与魔芋田间球茎相似）发生，后者长成的植株较健壮。

表3 继代培养3次后魔芋愈伤组织类型

2.4 魔芋微球茎的形成

微球茎诱导情况见图3，将获得的Ⅲ型愈伤组织转入含有5%蔗糖的微球茎诱导培养基后，经过4周培养，愈伤组织开始形成微球茎，继续培养至第8周可见大量生长良好的微球茎，该微球茎表皮浅褐色，带大量芽点，1～2cm大小。可见，5%蔗糖有利于促进微球茎的形成。

3 讨 论

魔芋在离体培养过程中一般需要经历2个过程，即愈伤组织诱导阶段和分化培养阶段。研究表明，分裂素6－BA与生长素NAA配合使用对魔芋愈伤组织诱导与分化具有明显促进作用［10－11］。本试验结果也进一步证实了该结论，不同浓度配比的6－BA与NAA可不同程度地诱导愈伤组织的发生。在诱导过程中，外植体的类型与愈伤组织的诱导率、颜色、质地具有密切联系。庄承纪［10］与谢庆华［12－13］等认为，根状茎是魔芋诱导愈伤组织的最佳外植体，而本研究结果发现，以叶柄为外植体其愈伤组织诱导效果均高于其他器官，包括根状茎。

图2 花魔芋愈伤组织的3种类型

图3 魔芋微球茎

魔芋组织培养过程中器官发生途径主要包括：外植体—愈伤组织—不定芽—生根成苗；外植体—愈伤组织—生根长芽成苗；外植体—愈伤组织—胚状体成苗以及外植体—愈伤组织—小块茎—成苗等［11，14］。由此可见，愈伤组织的状态对器官分化具有重要影响。Hu等认为，魔芋愈伤组织可形成3种不同类型，这3种类型愈伤组织在不同的培养条件下还可以相互转变［15］。本试验结果同样获得3种愈伤类型，即半透明Ⅰ型，浅灰褐色、愈伤组织结构疏松状的Ⅱ型，以及稍带绿色或者粉色，结构致密、质地坚硬的Ⅲ型愈伤组织。Ⅲ型的愈伤组织生理状态好，增殖频率较高，容易分化出不定芽和微球茎。但在培养过程中未发现相互转化现象，Ⅰ型愈伤在继代过程中出现褐化现象并死亡。同时试验表明，北川花魔芋器官发生途径主要为外植体—愈伤组织—不定芽—生根成苗和植体—愈伤组织—小块茎—成苗2种途径，后者中的小块茎即拟球茎，它具有与田间魔芋相同的繁殖方式，独立培养可以产生很多新的小球茎，实现了“器官－器官”的繁殖方式。拟球茎是一种微型变态繁殖器官，具有体积小、可贮运、易长苗、易生根等优点，在魔芋种芋繁殖中有望代替试管苗。

北川花魔芋的组织培养过程中，虽然成功诱导了具有分化能力的愈伤组织以及微球茎，但仍存在很多的问题，如魔芋微球茎诱导率的提高、繁殖过程中病毒、病源菌的脱病率等，尚待进一步的研究。

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