木霉菌对番茄灰霉病菌的抑制作用

甘 林，代玉立，杨秀娟，石妞妞，阮宏椿，杜宜新，陈福如*

(1.福建省农业科学院植物保护研究所，福建 福州 350013；2.福建省作物有害生物监测与治理重点实验室，福建 福州 350003)

木霉菌对番茄灰霉病菌的抑制作用

甘 林1,2，代玉立1,2，杨秀娟1,2，石妞妞1,2，阮宏椿1,2，杜宜新1,2，陈福如1,2*

(1.福建省农业科学院植物保护研究所，福建 福州 350013；2.福建省作物有害生物监测与治理重点实验室，福建 福州 350003)

为明确木霉菌对福建省番茄灰霉病菌的抑制效果，研究了8株木霉菌对病原菌的拮抗作用。结果表明，在对峙培养条件下，供试木霉菌能显著抑制灰霉病菌菌丝生长，其抑制率为86.83%～91.39%，不同木霉菌株的发酵液对病原菌菌丝生长具有不同程度的抑制效果，其差异达显著水平。其中，菌株FJ2006-8发酵液的抑制生长率最高，为39.44%。此外，供试的木霉菌均能产生非挥发性和挥发性代谢产物，其中，菌株FJ2006-8的非挥发性代谢产物对病原菌菌丝生长的抑制效果最佳，抑制率为61.09%；而菌株T05-58的挥发性代谢产物对病原菌菌丝生长的抑制率最高，为22.95%。研究结果可为木霉菌生防菌剂的开发以及番茄灰霉病的绿色防控提供理论依据。

木霉菌；番茄灰霉病菌；拮抗作用；代谢产物

番茄是福建省设施栽培中主要蔬菜品种之一，在生产中侵染番茄的病虫害种类繁多，其中以番茄灰霉病对番茄的生产为害尤为严重。该病害由灰葡萄孢菌Botrytiscinerea引起，主要为害番茄的茎、叶、花及果实，其中以为害幼果为主，常造成烂果。由于设施大棚较大田可保持较高的空气相对湿度和温度，因此，灰霉病的发生也日趋严重，在一般的年份平均叶发病率可达15%，造成的经济损失在40%左右[1]。目前生产上尚未有抗病的番茄品种，主要还是依靠化学杀菌剂进行病害的防治，常用的杀菌剂有异菌脲、啶酰菌胺、嘧霉胺、啶菌嗯唑等[2]。然而，由于灰霉病菌在种群上存在变异性，长期大量施用单一的杀菌剂不可避免地使得病原菌产生抗药性。此外，杀菌剂剂量的加大也带来了环境污染和对人类健康危害等问题，而生物防治因其具有高效、低毒、安全等特性，作为一项植物病害防治的重要措施已逐渐引起人们的高度重视。近年来，利用拮抗微生物及其生防菌剂进行灰霉病的防治已成为一项可持续的防治措施，从健康土壤和番茄果实上分离筛选到的真菌、细菌和放线菌及其代谢产物对番茄灰霉病菌均表现出较好的拮抗效果和防治作用[3-6]。

木霉菌Trichodermaspp.是自然界中普遍存在的，目前研究最多、应用最广泛的生防菌，可拮抗18个属20余种植物病原真菌[7]。主要通过重寄生、分泌胞外降解酶，产生代谢产物等一系列拮抗作用，有效抑制病原菌的生长，特别对疫霉病菌、黑星病菌、灰霉病菌等具有较强的拮抗作用[8-9]。目前，生产上登记销售、应用的木霉菌生防菌剂较多，然而关于木霉菌对灰霉病菌的拮抗作用和生防机理相关报道还较少[10-11]。本课题组前期利用实验室保存的47株木霉菌完成了对番茄灰霉病菌生防菌的初步筛选，获得了8株拮抗活性较好的木霉菌。本研究以此为基础，进一步分析、探明筛选出的木霉菌对灰霉病菌的抑制效果和作用机理，以期为木霉菌菌剂的研发与应用以及番茄灰霉病的绿色防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试病原菌为番茄灰霉病菌B.cinerea，由福建省农业科学院植物保护研究所分离自福清市番茄温室大棚中采集的病果，经分类鉴定，用柯赫氏法则验证其致病性；8株木霉菌由本课题组分离，-20℃滤纸片保存。

1.2 试验方法

1.2.1 平皿对峙培养 参照刘波微等[12]的方法。将供试番茄灰霉病菌和木霉菌分别接种于马铃薯葡萄糖(PDA)培养基中，(28±1)℃，黑暗培养4 d后，用5 mm打孔器分别打取灰霉病菌和木霉菌边缘菌丝体菌饼，在直径为90 mm的平板一侧接种病原菌，另一侧接种木霉菌，两者间距离约60 mm，同时以只接种病原菌为空白对照，每个处理4次重复，接种后置于(25±1)℃，黑暗培养。每隔6 h分别测量病原菌和木霉菌菌落生长半径，统计各自的增长速率，计算供试木霉菌对灰霉病菌生长的抑制率。此外，分别于42 、144 h后在平板和显微镜上观察木霉菌对病原菌菌丝生长的抑制情况。

菌丝增长速率=Σ(供试菌每6 h菌丝生长半径差)/7

1.2.2 木霉菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制作用测定 发酵液的制备参考甘林等[13]的方法。将培养4 d的木霉菌菌饼接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中(培养基装量为每250 mL三角瓶100 mL)，(28±1)℃、150 r·min-1恒温振荡培养4 d后，离心10 min，吸取上清液经细菌过滤器真空过滤后置于4℃冰箱中，备用。

将10 mL木霉菌发酵液与10 mL PDA培养基混匀，凝固后制成含发酵液平板，备用。将供试的番茄灰霉病菌接种于PDA培养基中，(28±1)℃，黑暗培养4 d后，使用5 mm打孔器打取病原菌边缘菌丝体菌饼，接种于发酵液平板中央，同时设置空白的PDA培养基平板作为对照，每组4次重复。(25±1)℃，黑暗培养7 d后，采用十字交叉法测量并计算病原菌菌落平均直径和抑制率。

抑菌率/%=[(对照菌落直径一处理的菌落直径)/对照菌落直径]×100%

1.2.3 木霉菌代谢产物对病原菌菌丝生长的拮抗活性测定 非挥发性代谢产物抑菌作用测定参考梁巧兰等[14]的方法。平铺双层无菌玻璃纸于PDA平板上，中央接种已培养4 d、直径为5 mm的木霉菌菌丝体菌饼，(28±1)℃，黑暗培养，待木霉菌菌丝长满玻璃纸前，用镊子移除表面的玻璃纸，在平板中央接种已培养好4 d，直径为5 mm的病原菌菌饼，同时设置在不接种木霉菌的PDA平板上接种病原菌为空白对照，每组4次重复。(25±1)℃，黑暗培养7 d后，采用十字交叉法测量病原菌菌落扩展直径，并计算抑菌率，计算方法同1.2.2。

挥发性代谢产物的抑菌活性测定参考钟小燕等[15]的方法。采用平皿对扣培养法，在2个PDA平板中央分别接种已培养4 d、直径为5 mm的灰霉病菌和木霉菌菌丝体菌饼，然后将2个平板的皿口相互对扣，用封口膜密封，其中接种木霉菌的平皿在下，接种病原菌的平皿在上，同时设置只接种病原菌，不接种木霉菌为空白对照，每组4次重复。(25±1)℃，黑暗培养7 d后，采用十字交叉法测量病原菌菌落扩展直径，抑菌率计算方法同1.2.2。

1.3 数据处理

试验数据用Microsoft Excel 2003、DPS软件处理工作平台进行统计和分析，采用Duncan氏新复极差法分析不同处理间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 平皿对峙培养对病原菌菌丝生长的抑制作用

供试木霉菌与灰霉病菌的对峙试验结果如表1所示，8株木霉菌的菌丝总体平均生长速度要明显快于病原菌。与对照相比，对峙培养42 h后，木霉菌对灰霉病菌菌丝生长速度抑制率均在80%以上，且供试木霉菌与病原菌之间未发现有明显的抑制带(图1-A)。之后木霉菌继续生长，并与病原菌菌丝发生接触，抑制病原菌的生长，144 h后木霉菌包围整个病原菌，布满整个培养皿，并在病原菌菌落上产生大量的孢子堆(图1-C)。显微观察可见，在木霉菌与病原菌接触处，木霉菌通过缠绕、紧贴等方式重寄生于病原菌之上，而病原菌菌落边缘的菌丝颜色也逐渐变浅，菌丝变形、变薄，甚至停止生长(图1-D)。

表1 平皿对峙下木霉菌对病原菌菌丝生长的抑制活性Table 1 Inhibition activity of Trichoderma spp. on B. cinerea in confrontation culture

2.2 木霉菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制作用

供试的木霉菌发酵液对番茄灰霉病菌菌丝生长表现出一定的抑制活性，对病原菌菌丝生长抑制率为10.36%～39.44%，各菌株间的抑制率差异达显著水平(表2)。其中，菌株FJ2006-8发酵液的抑制率最高，为39.44%，而菌株FJ2007-2的抑菌率最低，为10.36%。

表2 木霉菌发酵液对病原菌菌丝生长的抑制活性Table 2 Inhibition activity of fermentation broths of Trichoderma spp. on B. cinerea

2.3 木霉菌非挥发性代谢产物对病原菌菌丝生长的抑制作用

在平板对峙培养和发酵液抗生作用的试验结果基础上，进一步研究供试木霉菌对病原菌的作用机理。非挥发性代谢产物的抑菌试验结果(表3)表明，8株木霉菌均能产生抑制番茄灰霉病菌生长的非挥发性代谢产物。方差分析表明不同菌株间的抑菌强弱存在显著性差异。其中，菌株FJ2006-8对病原菌的抑制效果最佳，抑制率为61.09%，而菌株T05-48的抑制效果较差，抑制率为52.09%。

表3 木霉菌非挥发性代谢产物对病原菌菌丝生长的抑制活性

Table 3 Inhibition activity of non-volatile metabolites produced byTrichodermaspp. onB.cinerea

木霉菌菌株编号抑制率/%木霉菌菌株编号抑制率/%FJ2007⁃35273±123CcdFJ2006⁃86109±162AaFJ2010⁃515450±185BCbcdFJ2007⁃25563±129BCbcT05⁃585338±123BCcdC1⁃15691±074BbT05⁃495305±166CcdT05⁃485209±064Cd

2.4 木霉菌挥发性代谢产物对病原菌菌丝生长的抑制作用

从表4可以看出，供试木霉菌可通过释放挥发性代谢产物对病原菌菌丝生长产生一定的抑制作用，但总体抑菌效果不高。接菌处理后7 d，菌株T05-58对灰霉病菌菌丝生长抑制率最高，为22.95%，而菌株C1-1的抑制率最低，仅为3.16%。此外，通过后期平板观察病原菌菌丝生长情况发现，与对照相比，在挥发性代谢产物的作用下，其菌落边缘菌丝表现为稀薄。

表4 木霉菌挥发性代谢产物对病原菌菌丝生长的抑制活性Table 4 Inhibition activity of volatile metabolites produced by Trichoderma spp. on B. cinerea

3 讨论与结论

番茄灰霉病是设施大棚栽培过程中最易发生的重要病害之一。近年来，随着保护地番茄种植面积的不断扩大，大量种植高产、单一的番茄感病品种也给田间灰霉病菌的积累提供了有利的小环境，病害为害的程度也在逐年的加重[12]。由于生产上还未有抗病品种，而化学药剂防治高效，大多数菜农在防治番茄灰霉病时常选择使用化学药剂。然而，随着逐年施药剂量、次数地不断增加，灰霉病菌对常规杀菌剂的抗药性也在逐渐增大，目前生产上已出现了病原菌对灰霉病防治的特效药嘧霉胺抗性的菌株[16]。因此，开发新型、作用机理独特且对人畜和生态环境无害的生防菌剂成为目前农药开发的一个重要领域[17]，利用生物防治作为病害防治的一项重要措施也引起人们的高度重视。

木霉菌是一种应用较广的生防菌，其主要的作用机制包括竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗性及协同拮抗作用[18]。本研究通过平板对峙试验发现，供试的8株木霉菌生长速度明显快于病原菌，灰霉病菌菌丝生长抑制率为86.83%～91.39%。木霉菌与病原菌在产生营养或空间竞争的同时，也抑制了病原菌菌丝的扩展。此外，Inbar等[19]曾发现木霉菌能够通过产生带有凝集素的尼龙纤维识别、接触并缠绕病原菌，证实了凝集素是其进行识别靶标真菌的外源信号。显微观察发现，供试木霉菌的菌丝也可缠绕于病原菌菌丝之上形成重寄生，有的木霉菌还会产生分枝吸附在病原菌菌丝表面从而影响、破坏其生长，而接触木霉菌的灰霉病菌菌丝也会发生畸形，最终病原菌被木霉菌所覆盖，表面并伴有绿色孢子堆的产生。试验结果与前人的报道相符[20]。然而仅通过平板对峙培养只能筛选获得拮抗作用较好木霉菌，其在田间实际的防治效果还有待进一步研究。

木霉菌除了竞争作用和重寄生作用外，产生各种次生代谢物质对病原菌的抗生作用也是其重要的作用机理。目前，已报道有超过140种的木霉菌可产生抗生性的代谢产物，而这些代谢产物主要包括聚酮类、氨基酸及其衍生物、萜烯类等[21]。通过抑菌试验结果表明，8株木霉菌发酵液对灰霉病菌均具有一定的拮抗活性，不同菌株之间的抑菌率存在显著差异。然而，各木霉菌菌株发酵液对病原菌的抑制率总体水平不高，有报道称，发酵液在除菌制备过程中一些具有抗菌活性的大分子物质可能因细菌过滤膜孔径过小而无法通过，因而降低了其抗生效果[13]。本试验中供试木霉菌发酵液的抑菌率较低是否与这个原因有关，还需要进行进一步的分析。此外，木霉菌还能产生多种挥发性或非挥发性的抗菌素类物质，其中仅抗真菌的代谢产物就可多达32种以上，这些代谢产物的产生使得木霉菌即使不与病原菌菌丝发生接触也可引起其菌丝生长缓慢，甚至停止生长[22]。本研究在平板对峙试验中发现，对峙的病原菌菌丝稀薄，生长速度要显著慢于对照，而通过平板对扣试验和滤膜法试验也证实了供试的木霉菌均可产生挥发性和非挥发性的代谢物质，其中挥发性代谢产物对病原菌的抑菌率达22.95%，非挥发性代谢产物的抑菌率高达61.09%。挥发性代谢产物的抑制效果不如非挥发性代谢产物明显，可能与其具体的物质组成对灰霉病菌的抑菌作用存在差异有关。

目前，虽然木霉菌菌剂在生产上应用广泛，但在实际的生防应用中仍存在许多问题，如生防效果不稳定、在作物上的定殖能力低、受环境因素的影响等[23]。本研究通过平板对峙培养、发酵液和代谢产物的抗生作用试验，筛选到1株对番茄灰霉病菌抑制效果较好的木霉菌FJ2006-8，其在田间对病害的防治效果以及在番茄体内的定殖情况还需进一步的探明。此外，本研究发现木霉菌非挥发性代谢产物对病原菌的抑制效果较好，其代谢产物中具体的抑菌物质也有待于进一步研究。

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(责任编辑：林海清)

Antagonistic Effect ofTrichodermaspp. Strains onBotrytiscinerea

GAN Lin1,2, DAI Yu-li1,2, YANG Xiu-juan1,2, SHI Niu-niu1,2, RUAN Hong-chun1,2, DU Yi-xin1,2, CHEN Fu-ru1,2*

(1.InstituteofPlantProtection,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.FujianKeyLaboratoryforMonitoringandIntegratedManagementofCropPests,Fuzhou,Fujian350003,China)

Antifungal activities of 8 strains ofTrichodermaspp. onBotrytiscinereain Fujian was studied. By means of confrontation culture, all of the strains were shown to effectively inhibit the mycelial growth of the pathogen with inhibition rates ranging from 86.83% to 91.39%. The fermentation broths of theTrichodermastrains differed significantly in their inhibiting effects on hyphal growth of the pathogen. The broth from FJ2006-8 was found to render the highest inhibition rate of 39.44% among all. All tested strains produced volatile as well as non-volatile metabolites. The non-volatile metabolites produced by FJ2006-8 showed the greatest inhibitory effect, reaching a rate of 61.09%, while the volatiles from T05-58 exhibited the highest rate of 22.95%. The results would provide the needed information to develop a biocontrol agent fromTrichodermafor the disease on tomato plants caused by the gray mold.

Trichodermaspp.;Botrytiscinerea; antagonism; metabolite

2016-06-29初稿；2016-09-01修改稿

甘林(1981-)，男，硕士，助理研究员，研究方向：植物病害防治(E-mail:millergan@yeah.net) *通讯作者：陈福如(1961-)，男，研究员，研究方向：植物病害防治(E-mail:chenfuruzb@163.com)

福建省农业科学院青年基金项目(2014CX-16)

S 435

：A

：1008-0384(2016)11-1221-05

甘林，代玉立，杨秀娟，等.木霉菌对番茄灰霉病菌的抑制作用[J].福建农业学报，2016，31(11)：1221-1225.

GAN L，DAI Y-L，YANG X-J，et al.Antagonistic Effect ofTrichodermaspp. Strains onBotrytiscinerea[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1221-1225.