新型聚中性红膜修饰碳糊电极的制备、表征及应用

顾　玲，石爱华,武彩艳,张彦茹,张　苗

(1.陕西科技大学，教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西　西安　710021；

2.陕西华星电子集团有限公司，陕西　咸阳　712099)



新型聚中性红膜修饰碳糊电极的制备、表征及应用

顾玲1*，石爱华1,武彩艳1,张彦茹1,张苗2

(1.陕西科技大学，教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，陕西西安710021；

2.陕西华星电子集团有限公司，陕西咸阳712099)

摘要：运用一种新型的化学引发-电聚合方式将中性红膜固定到碳糊电极表面，制备出聚中性红薄膜修饰碳糊电极(PNR/CPE)。利用循环伏安法(CV)和交流阻抗谱(EIS)对修饰电极的电化学性能进行研究，借助于扫描电子显微镜(SEM)对修饰电极表面进行表征，并采用红外吸收光谱法(IR)和紫外可见吸收光谱法(UV-Vis)对PNR薄膜结构进行测试。结果表明，中性红成功地固定在碳糊电极表面，修饰电极的表面呈现特定的立体化结构，表面的电活性位点增多，电催化性能增大。在优化条件下，将该电极应用于鲱鱼精DNA(hsDNA)的检测，PNR电极上出现了1对较强的氧化还原峰，峰电流与其浓度在1.0×10-6~8.0×10-5mol/L 范围内呈良好的线性关系，检出限为1.0×10-7mol/L。

关键词：聚中性红;化学引发;碳糊电极;表征;鲱鱼精DNA(hsDNA)

修饰电极的表征主要有电化学和化学方法两类，常用的电化学表征方法有循环伏安法(CV)、交流阻抗谱(EIS)、计时电流法、计时电量法等。相对而言，化学表征方法多种多样，典型的有扫描电子显微镜(SEM)、红外吸收光谱法(IR)、紫外可见吸收光谱法(UV-Vis)、X射线光电子能谱(XPS)等[1]，其中EIS和SEM被广泛地应用于化学修饰电极的表征[2-3]。

中性红(NR)是一种良好的电子媒介体，是电极表面设计时常用的有机染料修饰剂，具有氧化还原性[4]，可以制备导电性良好的氧化还原薄膜修饰电极。聚中性红修饰电极的应用研究较多，但对其表面的表征研究较少[5]。

脱氧核糖核酸(DNA)是一种生物大分子，携带生物遗传因子，在生物的生命活动中起着重要作用[6]。生物体内DNA序列的微小改变会引起机体病变，与胚胎发育、肿瘤生长和癌症治疗息息相关，在药物分析与临床研究中，DNA作为体内抗癌药物的标靶[7]，可用于构造良好的几何体支架来进行药物研究和临床诊断，因此，DNA的分析检测在分子生物学和医学领域有着重要的研究意义[8]。目前，检测DNA的方法有荧光法[9]、电化学传感法[10-12]、杂交技术[13]、比色法[14]、扩增法[15]、高效液相色谱法[16]、计数法[17]、拉曼光谱法[18]、等离子体共振法[19]等，其中电化学传感器操作简单、微型灵敏[20]，但中性红染料修饰电极检测DNA的研究尚未见报道。本研究采用化学引发-电聚合的方法制备了一种新型的聚中性红膜修饰碳糊电极，并运用CV,EIS,SEM,UV和IR法分别对修饰电极表面进行表征，采用该电极对鲱鱼精DNA进行检测，从而为DNA的检测提供了新方法。

1实验部分

1.1仪器与试剂

LK98BⅡ型电化学分析系统(天津兰力科高技术有限公司)，CHI660e电化学工作站(上海辰华仪器公司)，三电极系统：裸碳糊电极和修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂丝电极为辅助电极；扫描电子显微镜(Hitachi S-4800型)；85-1恒温磁力搅拌器(常州国华电器有限公司);VECTOR-22型傅立叶红外光谱仪(FT-IR，德国Bruker公司)；DR5000型紫外可见吸收光谱仪(UV-Vis，美国Hatch公司)。

石墨粉(光谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；中性红(分析纯，上海试剂三厂)；含氢硅油(0.18%色谱纯)；K2S2O8(分析纯，西安化学试剂厂)；过氧化苯甲酰(BPO，分析纯，天津市福晨化学试剂厂)；(NH4)2S2O8(分析纯，天津市化学试剂六厂)；鲱鱼精DNA(Sigma公司)；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水，所有实验均于室温下进行。

1.2电极的制备

1.2.1裸碳糊电极(CPE)的制备及活化将质量比为4∶1的石墨粉和含氢硅油放入研钵中混合均匀，研磨呈糊状，在内径3 mm的聚四氟乙烯管的一端内填入碳糊，管的另一端插入铜丝作为导线，将制备好的电极在称量纸上抛光后备用。更新电极表面时，挤出碳糊1~2 mm切除即可。测定或修饰前需将其置于空白底液中活化。

1.2.2中性红修饰碳糊电极(PNR/CPE)的制备将预处理的CPE置于1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(PB)+ KNO3底液中活化，取出晾干后再将其浸入含0.1 mmol/L NR+1/15 mol/L PB(pH 5.91)+0.3 mol/L KNO3+6.0 mmol/L K2S2O8的聚合溶液中，65 ℃下恒温搅拌5 min，待溶液冷却后，通过CV法在-0.80~0.80 V电位范围内以50 mV/s扫描40圈，取出电极，用水冲洗，自然晾干，即制得化学引发-电聚合的PNR/CPE。

1.3实验方法

运用SEM对所制备的电极进行表征，观察电极表面的形貌；将电极置于电解质溶液中，利用CV和EIS法对其电化学性能进行研究；将聚合前和聚合后的CPE通过UV与IR方法进行对比分析，对其聚合机理进行推测。以PB+1.0 mmol/L鲱鱼精DNA为测定体系，于-0.80~0.00V电位范围内以100 mV/s的扫描速率进行DPV测定，记录各浓度下的I~E曲线。

2结果与讨论

2.1PNR/CPE的表面形貌

利用SEM对裸碳糊电极(CPE)和新型修饰碳糊电极(PNR/CPE)的表面进行观察，由图1可见，CPE表面(图1A)呈片状结构，较为平整，而PNR/CPE表面(图1B)在片状结构的基础上布满了大量不规则的球状颗粒。这种特异的表面形貌表明中性红已成功修饰在碳糊电极表面，且球状结构增大了电极的表面积，增加了电极表面的活性位点，同时也增加了电极与待测物质的接触面积，有利于电极电催化的进行。

2.2PNR/CPE的电化学性能表征

将经过活化的CPE和PNR/CPE分别置于以KCl为支持电解质的1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)]6溶液中，在-0.20~0.80 V电位范围内以100 mV/s扫速进行循环伏安扫描。由图2可知，两支电极上均出现1对较强的氧化还原峰，与CPE(曲线a)上的峰电流(Ipa=16.02 μA;Ipc=22.21 μA)相比，PNR/CPE(曲线b)上的峰电流(Ipa=20.12 μA;Ipc=27.37 μA)明显增大，是裸电极上峰电流的1.4倍，而且峰形更尖锐，还原峰电位有微小的正移。由此说明，中性红已被固定在电极表面，形成了聚合物薄膜修饰电极，由于中性红本身是活泼的电子转移体，使K3[Fe(CN)]6在修饰电极表面的电子转移速率增加，从而提高了K3[Fe(CN)]6在该电极上发生氧化还原过程的可逆性，增强了电极的电催化性能。

采用交流阻抗法研究了CPE和PNR/CPE在1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)]6溶液中的阻抗谱图(如图3)，电极的电荷转移电阻(Ret)在数值上等于阻抗谱图半圆的直径。由图3可知，CPE(曲线a)的半圆弯曲弧度较PNR/CPE(曲线b)的弯曲弧度大，所以CPE的电荷转移电阻比PNR/CPE的电荷转移电阻大。当电极表面修饰上中性红后，PNR/CPE阻碍电子传递的能力减小，这是因为修饰电极的表面积增大，电催化活性位点增多，提高了电子转移速率，间接地说明中性红被修饰到裸碳糊电极表面，降低了电荷转移电阻，提高了修饰电极的电催化性能。

2.3中性红聚合物薄膜的结构表征

2.3.1UV-Vis光谱分析用四氢呋喃将PNR/CPE表面的中性红聚合物溶解出，在相同的pH值条件下，对中性红单体(NR)和聚合物(PNR)进行紫外光谱测定，结果见图4。由图可见，在普通紫外区，NR和PNR在291,275，250 nm处分别有1个吸收峰，聚合物的吸收峰发生较小的蓝移，根据中性红的分子结构式，此处是苯环和杂环化合物的吸收峰；在可见紫外区，NR在525 nm和440 nm处分别有1个紫外吸收峰，但440 nm处的吸收峰不明显，被525 nm处的吸收峰掩盖，形成一个肩峰，而PNR仅在440 nm处有一个明显的可见吸收峰。据推测，中性红经过聚合后，结构发生了变化，525 nm处的吸收峰消失，440 nm处的吸收峰反而增强，可能是某些官能团发生改变，导致了蓝移现象的发生。另外，空间位阻等因素对分子有效共轭程度的影响也会导致此现象。研究结果进一步说明经过化学引发后制备的电极表面存在中性红聚合物。

2.3.2红外光谱(IR)分析为了进一步证明中性红被修饰在碳糊电极表面，对中性红聚合物的结构进行了红外光谱鉴定，结果如图5所示。

图5A中3 127 cm-1与3 320 cm-1处的两个峰是NR中伯胺的ν(N—H)，表明中性红单体以—NH2形式存在，在2 960 cm-1左右有一个小吸收峰，为苯环中C—H的吸收峰，1 198，1 327，1 497，1 627 cm-1处是苯环的骨架振动峰。图5B中3 400~3 500 cm-1之间的吸收峰是共轭度较大的聚合物大分子的ν(N—H)，1 375 cm-1处是—CH3的弯曲振动，其余的吸收峰和NR红外谱图中的峰位相同，为苯环的骨架振动峰，800 cm-1左右是苯环二取代的吸收峰。对比两者发现，经过聚合后化合物的红外谱图中3 400~3 500 cm-1处的吸收峰较强，3个峰未完全分开，可能是中性红聚合物结构中伯胺与仲胺的吸收峰。物质的分子结构发生了改变，由此进一步证实，经过化学引发-电聚合的方式，中性红单体发生了聚合转变为聚合物，被修饰到裸碳糊电极表面，增加了电极表面的电活性位点，可以促进物质的电催化氧化。

2.4hsDNA在PNR/CPE上的电化学响应

将CPE与PNR/CPE置于1.0×10-3mol/L hsDNA+Na2HPO4-C6H8O7的待测体系中，于-0.40~0.60 V电位范围内，以100 mV/s扫速进行循环伏安检测。如图6所示，CPE(曲线a)对hsDNA无电化学响应，循环伏安曲线平滑，裸电极上无任何峰出现，但在PNR/CPE(曲线b)上出现了1对明显的氧化还原峰(Epa=0.075 V，Epc=-0.033 V)，说明修饰电极对hsDNA具有很好的电化学响应，可用于hsDNA的测定。

2.5引发剂的选择

中性红作为修饰剂时常采用电引发方法制备修饰电极[5]，而本研究基于中性红的聚合机理采用化学引发的手段，将过硫酸钾、过硫酸铵和过氧化苯甲酰作为中性红聚合的引发剂，制备出3种不同的修饰电极，分别对hsDNA进行检测。结果显示，hsDNA在过氧化苯甲酰作为引发剂时制备的PNR/CPE上的氧化还原峰电流较弱；而过硫酸铵作为引发剂时，hsDNA的催化氧化还原峰电流较强；当用过硫酸钾作为引发剂时，修饰电极对hsDNA的响应最强。由此表明，过硫酸钾作为引发剂时，中性红在电极表面更容易发生聚合，聚合效果较好。此外，中性红聚合只出现了还原聚合峰，可推断过硫酸钾在引发聚合的同时还对中性红进行了氧化，而还原态的中性红具有更多的电活性位点，促进了hsDNA的氧化还原反应。因此本研究选用过硫酸钾为聚合时的引发剂。

2.6化学引发时温度对电极的影响

化学引发时引发剂对温度有较高的要求，所以引发温度是影响中性红聚合的重要因素。实验考察了在50，55，60，65，70，75 ℃下制备的PNR/CPE对鲱鱼精DNA的响应。结果显示，当温度较低时，其还原峰电流值较小，随着温度升至60 ℃，还原峰电流急剧增大，温度升至65 ℃时，峰电流最大，此后继续升高温度，峰电流逐渐下降。说明温度升高对中性红聚合前的引发有一定的促进作用，使中性红聚合物更容易固定在电极表面，并以65 ℃时中性红的聚合效果最好，为最佳引发温度。但随着温度进一步升高，电极表面发生了沸裂，破坏了修饰电极的表面结构，导致该电极的电催化性能急剧下降。

2.7线性范围与检出限

在优化实验条件下，运用差分脉冲伏安法(DPV)，以Na2HPO4-C6H8O7缓冲液+不同浓度的hsDNA作为工作溶液，进行检测。结果显示：在1.0×10-6~8.0×10-5mol/L范围内，hsDNA的峰电流与其浓度呈良好的线性关系，线性方程为Ipc=0.001 75c+0.767(r=0.993 4)，检出限(S/N=3)为1.0×10-7mol/L。

2.8重现性、稳定性及干扰实验

用同一支PNR/CPE对hsDNA溶液平行测定6次，相对标准偏差(RSD)为4.8%，新制备的修饰电极在空白溶液中放置1周后，在相同条件下测定hsDNA，电流降幅不大，说明此电极的重现性和稳定性较好。

3结论

本研究表明,与CPE对比，新型的中性红聚合薄膜内具有多个电化学活性位点，阻抗电荷传导的能力下降，提高了电子转移速率。UV-Vis与IR光谱结果说明中性红分子结构发生了变化，从分子层面验证了中性红经过化学引发-电聚合的方式发生聚合。此外，PNR/CPE对hsDNA有很强的电化学响应，实现了有机染料修饰碳糊电极测定生物大分子的预期，建立了一种hsDNA的电化学检测新方法。

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皮蛋新“国标”实施铅含量不得大于0.5 mg/kg

皮蛋因其丰富独特的口感受到很多人的喜欢，但是其生产过程中是否含铅让人心有顾忌。不过自2015年12月1日起，皮蛋也有了新的国家标准。由质检总局、国家标准化管理委员会发布的新规规定，皮蛋的铅含量不得大于0.5 mg/kg。

据了解，我国首次发布针对皮蛋的国标是在1988年，编号为GB/T 9694-1988，这项标准目前已经废止，取而代之的是新国标GB/T 9694-2014，新国标于2014年12月发布， 2015年12月1日起实施。新国标中指出，“本标准与GB/T 9694-1988《皮蛋》相比，改写了'铅、铜、砷、锌'指标为'污染物指标总砷、铅、总汞和镉应符合GB2762的规定'，并删去铜和锌的指标要求。”同时，新“国标”中删去了对于传统工艺生产的溏心皮蛋其铅含量应该小于等于3 mg/kg。

近年来，在各地食品质量抽查中，不合格皮蛋总是榜上有名。据了解，皮蛋类产品的不合格项主要为铅含量和食品标签(未标注净含量)。

(信息来源：中国经济网)

Study on Preparation,Characterization and Application of a Novel Poly Neutral Red Film Modified Carbon Paste ElectrodeGU Ling1*，SHI Ai-hua1,WU Cai-yan1,ZHANG Yan-ru1,ZHANG Miao2

(1.Key Laboratory of Auxiliary Chemistry & Technology for Chemical Industry Ministry of Education,Shaanxi University

of Science & Technology,Xi’an710021,China；2.Shaanxi Huaxing Electronic Group

Co.Ltd.,Xianyang712099,China)

Abstract：A novel poly neutral red film modified carbon paste electrode(PNR/CPE) was prepared by chemical initiation-electrochemical polymerization.The electrochemical properties of the modified electrode were characterized by cyclic voltammetry(CV) and electrochemical impedance spectroscopy(EIS),the surface morphology of the ploy neutral red film was observed by scanning electron microscopy (SEM).Meanwhile,the membrane structure of PNR was tested and analyzed by ultraviolet visible absorption(UV-Vis) and infrared absorption spectrometry(IR).The result showed that the neutral red was modified successfully on the surface of carbon paste electrode,and the surface of PNR/CPE had a specific three-dimensional structure,in which the electroccatalytic performance was improved with the increase of the electroactive sites of the surface.Under the optimal experimental conditions,the modified electrode was applied in the detection of herring sperm DNA(hsDNA).The result indicated that a pair of obvious redox peak appeared on the PNR/CPE,the peak currents and concentrations of hsDNA had a good linear relationship in the range of 1.0×10-6-8.0×10-5mol/L with a detection limit of 1.0×10-7mol/L.

Key words：ploy neutral red;chemical initiation;carbon paste electrode;characterization;herring sperm DNA(hsDNA)

中图分类号：O657.1;Q523

文献标识码:A

文章编号：1004-4957(2016)01-0085-06

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.014

通讯作者：*顾玲，副教授，研究方向：电化学分析，Tel：15091802996，E-mail:gul@sust.edu.cn

收稿日期：2015-05-05；修回日期：2015-07-01