我国部分汉族人群MYH9多态性与终末期肾病的关联研究①

石理华　刘　乾　刘　沙③　梁彦军　赵国平　李　瑛　胡役兰　李　辉　魏茂提

(武警后勤学院附属医院肾脏病学研究所，天津300162)



我国部分汉族人群MYH9多态性与终末期肾病的关联研究①

石理华刘乾②刘沙②③梁彦军赵国平④李瑛胡役兰④李辉魏茂提④

(武警后勤学院附属医院肾脏病学研究所，天津300162)

①本文受武警后勤学院博士启动金课题支持(No.WHB2013010，WHB201208)。

②共同第一作者。

③武警西藏总队医院，拉萨850000。

[摘要]目的： 探索我国部分汉族人群非肌性肌球蛋白9(MYH9)基因第22号外显子与24号外显子间基因序列多态性与终末期肾病(ESRD)的关系。方法：采用以医院为基础的病例对照研究设计，纳入180例ESRD患者，并选择同期体检118例作为对照人群。采用PCR后测序策略检测MYH-9基因多态性，运用Phase2.0软件计算多态性位点连锁关系，转录因子结合位点分析采用网络AliBaba2软件完成。结果：采用双向测序共发现8个基因片段多态性位点，其中5个为新发多态性位点，3个为以前报道的多态性位点。新发多态性位点中，有2个多态性位点(G489A和A616C)位于MYH9基因第23内含子中。关联研究发现，G489A仅存在于ESRD患者中，与对照组比较有显著差别(P=0.013)，该结果提示该基因转换可能是危险因素。以前文献报道的Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)及Rs4821481(MYH9-787)未见与ESRD相关。连锁分析结果显示TCTCGGAT为最常见连锁形式，但ESRD人群该连锁基因型频率稍低于对照组，而TCTCGGCT和TCTCAGAT在ESRD人群出现频率较对照人群高。转录因子结合位点分析，MYH9基因第23内含子的野生型转录因子结合位点数量少于基因突变后的数量。结论：我国汉族人群MYH9基因23内含子附近基因序列的多态性及其连锁关系可能与ESRD发生、进展相关，该基因可能通过基因突变造成该区域转录因子结合位点数量改变来影响疾病的进程。

终末期肾病(End-stage renal disease ESRD)是一种肾脏各项功能几乎完全衰竭的常见的复杂性疾病，需要通过肾脏替代治疗即肾移植或透析来维持生命，是慢性肾病的最终结局。环境和遗传因素被认为是ESRD发生及进展的原因。在遗传因素中，载脂蛋白L1(Apolipoprotein L1 gene，APOL1)和非肌性肌球蛋白9(The non-muscle myosinⅡ A gene 9， MYH9)基因多态性是大多数ESRD的易感因素[1,2]。MYH9基因第23号内含子的rs4821480、rs2032487和rs4821481位点以及第13号内含子的rs3752462位点上的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)及连锁基因型与慢性肾病相关[2-4]。然而，这种易感性在不同种族之间存在明显的不同。如，O′Seaghdha等[5]研究证实MHY9/APOL1区域的rs4821480位点的SNP与欧洲裔非糖尿病肾病相关，但这种相关唯独在非洲裔人群中存在。进一步研究发现，E-1等位基因(GCCT)在亚洲人群分布更少[6]。可见，不同种族的MHY9基因多态性与ESRD的关系尚需进一步研究。

MYH9基因长度为139 389个碱基，含有40个外显子[7]。鉴于MYH9基因在ESRD中的重要作用和不同民族分布差异，本研究纳入汉族人群作为研究对象，探索MYH9基因多态性与ESRD的关系。

1材料与方法

1.1研究对象选择本研究获得武警后勤学院附属医院伦理委员会同意，并与参与者签订知情同意书。本实验采用病例对照研究设计，病例组选择中国北方某医院血液透析中心行维持性血液透析的患者370例，符合ESRD诊断标准。经过充分沟通，共211例患者同意为本实验提供血样，2012年6~8月间分别对211例患者进行标本采集。对照组人员来自该医院同期进行健康体检的部分医院医务人员1 210例，经年龄、性别、民族等混杂因素匹配之后根据课题组实际情况，共选取对照118例。

所有病例组患者均为中国汉族人群，主要来自华北地区，明确诊断为ESRD患者，于该院透析中心行血液透析治疗时间1~17年，平均(5±3.3)年。纳入研究211例，其中男127，女81例。但是，本研究中成功获得MYH-9基因多态性的样本是180例，男107，女73例，31例未能获得MYH-9基因多态性结果。平均年龄(53.13±11.29)岁，平均BMI指数22.75±3.76。ESRD病人中，包括慢性肾小球肾炎46.41%(97/209)、糖尿病肾病性20.10%(42/209)、高血压肾损害性11.48%(24/209)、梗阻性肾病6.22%(13/209)、家族遗传性多囊肾性1.44%(3/209)、狼疮肾炎性及肾脏肿瘤原因导致的ESRD患者与其他能区分具体原因的14.35%(30/209)等。对照组患者均为中国北方汉族人群，共118例(此为实际有效的对照组人数)，其中男性70例，女性48例，平均年龄(50.5±11.43)岁，排除各类泌尿系统内科及外科疾病、妊娠、自身免疫性疾病、近期感染、手术、创伤等疾病。病例组和对照组在性别(ESRD：男/女为82/127；对照组：男/女为48/70)无显著差异(χ2=0.07,df=1,P=0.80)。两组研究对象年龄段分布无显著差异(χ2=7.23,df=5,P=0.30)。

1.2实验方法本次研究实验室技术主要采用聚合酶链反应-直接测序分型技术(PCR-SBT)，主要过程包括：全血白细胞分离、全基因组DNA提取、含有特异SNP位点的基因片段扩增和测序。参考MYH-9基因发表的基因序列(GenBank accession number：3135984)设计引物(由www.ncbi.nlm.nih.gov网站的工具Primer设计PCR引物)。上游引物5′-ATGACTCGCCCGGAAATCTG-3′和下游引物5′-AGCATGAGGGCTTCTGCTTA-3′(引物由英潍捷基贸易有限公司，中国北京)合成。PCR反应体系:10×buffer 3 μl，上下游引物(10 mmol/L)各0.25 μl，dNTP (2.5 mmol/L)0.5 μl，Taq 酶(5 U/μl)0.5 μl，DNA 模板5 μl，双蒸水加至30 μl。扩增条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，57℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35个循环，72℃终末延伸10 min。PCR产物直接送公司测序。

根据测序结果人工判读多态性位点。测定点出现单峰，即该位点为纯合子型，出现双峰该位点为杂合子型。国外研究提示，MYH9基因rs4821480位点上可能出现TT或GG纯合子单峰表现，也可能是T/G杂合子的双峰表现；MYH9基因rs4821481位点上可能出现TT或CC纯合子单峰表现，也可能是T/C杂合子的双峰表现；MYH9基因rs2032487位点上可能出现TT或CC纯合子单峰表现，也可能是T/C杂合子的双峰表现；根据测定序列的峰型，判定SNP位点基因多态性结果。

2结果

2.1MYH-9基因多态性分布本研究设计纳入的基因片段包含MYH-9基因Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)的3个SNP位点，扩增产物大小为901 bp。通过双向测序人工判读测序图谱，结果发现本研究中除了前期报道的Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)SNP位点外，还另外发现5个新的SNP位点。这5个新发现的位点位于本研究片段的119位、308位、489位、600位及616位。所有多态性位点均符合HW平衡(P>0.05)，样本为随机婚配群体，病例间无遗传关系。Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)三个基因位点基因型均为TT纯合子型。在新发现位点中，以489位(G489A)和616位(A616C)突变型最为常见，而119位(C119T)、308位(C308T)、600位(A600C)的多态性位点突变型较少(见表1)。

2.2MYH-9基因多态性与ESRD的关系489位的碱基G到A转换仅在病例组(9/171)中出现，对照组中均为G，两组有显著差别(Fish精确检验，P=0.013)。616位多态性在两组研究对象分布基本一致(χ2=1.46，df=2，P=0.227)。然而，前人报道的Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)三个位点多态性在中国汉族人群却均为TT纯合子型[8，9]，未见与ESRD之间相关性。

连锁结果分析显示，TCTCGGAT为最常见的单倍体基因型，分别占ESRD和对照组人群的90%以上，但该单倍体型病例组出现频率又低于对照组趋势。而TCTCGGCT 和TCTCAGAT单倍体型出现频率却又高于对照组的趋势(表2)。

2.3MYH-9基因多态性对基因转录的影响通过对本研究MYH9基因片段的转录因子结合位点(transcription factor binding sites)分析(http://www.gene-regulation.com/)，结果显示本片段由野生型的98个增加至突变型的104个，仅在第23内含子区这个数据就由82个增加至85个。

表1我国部分地区汉族ESRD和对照组人群MYH9基因多态性结果

Tab.1Polymorphism of MYH9 gene segment in ESRD patients and control of Han population

SNPPolymorphismCaseControlStatisticsPMYH9-119CC179117Fisher'sExactTest1.00CT10MYH9-308CC179117Fisher'sExactTest1.00CT10MYH9-489GG171117Fisher'sExactTest0.013GA90MYH9-600CC179117Fisher'sExactTest1.00CT10MYH9-616AA164111χ2=1.460.227AC166

表2我国部分地区汉族ESRD和对照组人群MYH9基因连锁分析结果

Tab.2Linkage distribution of MYH9 gene segment SNP in ESRD patients and control of Han population

HaplotypeCaseEstimatedfrequencyS.E.ControlEstimatedfrequencyS.E.TCTCGGAT0.9187180.0018360.9700850.000001TCTCGGCT0.0436160.0012710.0256410.000000TCTCAGAT0.0285040.0018360.0000000.000000TCTCGAAT0.0027780.0000000.0042740.000000TTTCGGAT0.0027780.0000000.0000000.000000TCTTGGAT0.0015540.0013790.0000000.000000TCTTAGAT0.0012230.0013790.0000000.000000TCTCAGCT0.0008280.0012710.0000000.000000

3讨论

各种原因所致的慢性肾脏疾病发展成为ESRD可能通过共同途径所致。这些过程包括上皮细胞间质化、炎症、纤维化等造成肾小球和肾小管间质化，最终造成肾脏功能丧失。通过全基因混合扫描(Genome-wide admixture scan)研究策略，比较不同遗传背景人群ERSD发生情况的差异，成功确定ESRD的易感基因之一是MYH-9基因[2]。

MYH-9基因位于22号染色体长臂12.3-13.1区(22q12.3-13.1)，基因全长约110 kb，包含40个外显子，该基因在遗传过程中高度保守[7]，该基因编码的蛋白在肝脏、肾脏及血小板中表达丰富。在肾脏，MYH-9基因编码的产物主要在肾小球，特别是足细胞、肾小管周围毛细血管、肾小管表达。肌球蛋白的异常聚集、肾小管上皮细胞及足细胞细胞骨架的损害都可能造成肾脏病的进展。为此，MYH-9与ESRD的相关研究逐渐被人们重视。

研究显示[2,5]，许多与肾脏病相关的MYH-9基因的SNPs位于内含子12~23之间，跨越约14.9 kb，包括4个标记点SNPs(rs4821480、rs2032487、rs4821481和rs3752462)。这四个SNPs同时也是组成E1风险单倍型的主要位点。其中位于23内含子的SNP位点，rs4821481，在各项研究中均表现肾脏疾病关联性最强、最持续，然而相对于E1风险单倍型而言(60%非裔美洲人群，4%欧裔美洲人群)，E1有着与肾脏病更强的相关性[5]。为此，本研究最初也是基于对这些文献发表结果分析选定已经发表有意义的位点在我国汉族人群中进行探索研究。然而，本研究结果显示Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)三个位点SNP并未见与ESRD有显著关联，该研究结果与我国其他研究相似[8，9]。幸运的是，本研究发现上述三个位点附近的其他位点SNP可能与ESRD有关。如，本研究中489位的等位基因碱基由G到A转换仅在病例组(9/171)中出现，对照组中均为G等位基因，两组有显著差别(Fish精确检验，P=0.013)。进一步进行转录子分析，结果发现突变型MYH9基因片段的转录因子结合位点数量显著增加。为此，本研究推测该基因位点的多态性影响ESRD可能通过影响该基因表达来实现。有研究推测，MYH9 基因与ESRD相关可能直接影响慢性肾脏病患者的蛋白尿水平或者通过直接影响血压，从而影响疾病进展来实现[9]。

资料调研和本研究结果显示，国外证实的与ESRD相关的多态性位点在我国资料中却未见显著关联。可能由于不同种族导致MHY9基因多态性不同，从而造成该基因多态性与ESRD的关系不同的原因。为此，我国部分汉族人群MHY9基因多态性与ERSD的关系需要进一步研究证实。我国研究资料显示，本研究和其他研究结果提示我国部分汉族人群MYH9基因多态性具有独特的特点。如，本研究三个位点Rs4821480(MYH9-92)、Rs2032487(MYH9-273)和Rs4821481(MYH9-787)的多态性却均为TT纯合子型，这与我国其他研究结果相近[8,9]。国际SNP数据库结果也显示(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP /snp_ref.cgi?rs= 2032487)亚洲人群TT基因型频率在99.0%~100%之间，而非裔美国人这三个位点的TT型频率分别为13.0%、13.4%和13.5%[10]。该基因相同位点多态性存在如此大差异，提示我国该基因多态性与ERSD的关联之间可能存在独特特点。因此，开展我国人群的MYH9基因多态性与ESRD关联研究可能会有新的发现，也应该注意我国研究结果可能与国外研究结论不同。

总之，我国汉族人群MYH9基因23内含子附近基因序列的多态性及其连锁关系可能与ESRD发生和进展相关，该基因可能通过基因突变造成该区域转录因子结合位点数量改变来实现其作用。

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[8]Cheng W,Zhou X,Zhu L,etal.Polymorphisms in the nonmuscle myosin heavy chain 9 gene(MYH9)are associated with the progression of IgA nephropathy in Chinese[J].Nephrol Dial Transplant,2011，26(8):2544-2549.

[9]刘丽萍，王彩丽，范俊英.MYH9 基因多态性与内蒙古地区慢性肾脏病患者病情进展的相关性研究[J].中国中西医结合肾病杂志,2013，14(2)：142-145.

[10]Freedman BI,Hicks PJ,Bostrom MA,etal.Polymorphisms in the non-muscle myosin heavy chain 9 gene(MYH9)are strongly associated with end-stage renal disease historically attributed to hypertension in African Americans[J].Kidney Int,2009，75(7):736-745.

[收稿2015-04-16修回2015-10-20]

(编辑倪鹏)

[关键词]终末期肾病(ESRD)；非肌性肌球蛋白重链ⅡA(MYH9)多态性；汉族人群

Association of MYH9 SNPs with end-stage renal disease in Chinese Han population

SHILi-Hua,LIUQian,LIUSha,LIANGYan-Jun,ZHAOGuo-Ping,LIYing,HUYi-Lan,LIHui,WEIMao-Ti.ResearchInstituteofNephrology,DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForces,Tianjin300162,China

[Abstract]Objective:To explore the associations of MYH9 gene polymorphisms with ESRD in Han population in the fragment between exon 23 and 24.Methods: A hospital-based case control study was carried out including 180 patients and 118 controls in this study.Single nucleotide polymorphisms of MYH9 gene were determined using PCR sequencing,and the haplotypes were calculated using phase software(version 2.0),and transcription factor binding sites were predicted using AliBaba2.Univariate analysis was conducted for exploring the associations between polymorphisms and ESRD.Results: Five newly discovered and three previously reported SNP loci[Rs4821480(MYH9-92),Rs2032487(MYH9-273) and Rs4821481(MYH9-787)]were homozygote genotyped by bidirectional sequencing.Among newly discovered polymorphisms,two were found at the 489 locus(G→A)and the 616 locus(A→C) in the 901 bp fragment which located in the intron 23 of MYH9 gene.A G489A transversion was very likely a risk mutation contribute to the occurrence of ESRD(P=0.013).No association was observed between ESRD and three previous reported sites [Rs4821480(MYH9-92),Rs2032487(MYH9-273)and Rs4821481(MYH9-787)].The most common haplotype was TCTCGGAT,which was less frequent in the cases than that in the controls.Moreover,TCTCGGCT and TCTCAGAT haplotypes were more in the cases than that in the controls.The number of transcription binding sites increased from 82(wild)to 85(mutation)in the 23th intron of MYH9 gene.Conclusion: Polymorphisms of MYH9 at intron 23 may influence the prevalence of ESRD in Chinese Han population and TCTCGGAT haplotype may be one protective haplotype.TCTCGGCT and TCTCAGAT may be risk haplotypes attributed to ESRD.The polymorphism of MYH9 at the 23th intron may company with the amount alteration of transcription factor binding sites.

[Key words]End-stage renal disease(ESRD);The non-muscle myosinⅡA gene(MYH9);Han population

作者简介：石理华(1972年-)，男，博士，副主任医师，主要从事肾脏病学研究，E-mail：shilihua1972@163.com。

通讯作者④，武警后勤学院部队流行病学与统计学教研室，天津300309。

中图分类号R692

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)01-0079-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.01.017