兔艾美耳球虫分子生物学鉴定技术研究进展

樊翀宇，吕继洲，杨晓野，吴绍强*

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京 100029)



兔艾美耳球虫分子生物学鉴定技术研究进展

樊翀宇1,2，吕继洲2，杨晓野1，吴绍强2*

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所，北京 100029)

感染兔的艾美耳属球虫主要有11种，其对世界养兔业的危害日益严重。论文综述了国内外兔艾美耳球虫分子生物学鉴定技术的研究进展，基于不同靶标序列分类总结和分析了鉴定技术的优点和存在的问题，展望了未来兔艾美耳球虫分子生物学鉴定技术的应用前景和发展趋势，以期为兔艾美耳球虫病的诊断、预防和控制提供技术手段和方法依据。

兔；艾美耳球虫；分子生物学；鉴定技术

兔球虫病是家兔中常见的一类寄生虫病，对养兔业危害很大，是养兔生产中长期存在的一个难题。各品种家兔对艾美耳球虫(Eimeria)都易感染，特别是断奶到4月龄的小兔最易发病[1]。幼兔的球虫感染率一般为90%，病死率为40%～70%[2]。耐过球虫病未死亡的或经治愈的家兔多成为长期带虫者，是该病的传染源[3]。鉴于兔球虫病危害的严重程度，我国农业部将其列入《一、二、三类动物疫病病种名录》中的二类动物疫病。为防止该病跨境传入传出，2013年发布的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中也收录了兔球虫病。

兔球虫病主要是由寄生在肠道和胆管上皮细胞的艾美耳属球虫引发[4]。世界上已报道的感染兔的艾美耳球虫包括斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)、小型艾美耳球虫(E.exigua)、中型艾美耳球虫(E.media)、大型艾美耳球虫(E.magna)、黄艾美耳球虫(E.flavescens)、盲肠艾美耳球虫(E.coecicola)、肠艾美耳球虫(E.intestinalis)、无残艾美耳球虫(E.irresidua)、梨形艾美耳球虫(E.piriformis)、维氏艾美耳球虫(E.vejdovskyi)及穿孔艾美耳球虫(E.perforans)[5-8]。

兔球虫病传统上以粪便检查为主要确诊手段，通过对粪便中卵囊的形态学及培养特性，主要是球虫卵囊的大小、形态、内部构造及发育时间等特征进行鉴定，确定感染球虫种类[9]。但是，依靠形态学鉴定球虫种类容易出现如下问题：首先，全面掌握所有11种兔球虫种类的形态学特征及区分方法需要耗费大量的时间，而且十分困难；其次，不同种类兔球虫卵囊之间的形态、大小极为相近，即使经验丰富的专家也难以将它们区分。除此之外，兔球虫感染往往是肠道兔球虫和肝脏兔球虫同时感染，单一个体内存在2种或2种以上兔球虫的情况比较普遍[10]。基于上述原因，研发兔球虫病病原种类的特异性诊断技术及简便易行的分子生物学种类鉴定方法势在必行。

本文就近年发展起来的有关感染兔的艾美耳球虫的分子生物学鉴定技术和方法进行了综述与探讨，以便为兔球虫病的分子生物学诊断体系的建立与应用提供参考。

1　兔艾美耳球虫分子生物学鉴定方法

1.1基于核基因组的鉴定技术

1.1.1普通PCR方法2010年，崔平等分别成功分离了肠艾美耳球虫[1]、黄艾美耳球虫[11]和大型艾美耳球虫[12]卵囊并提取基因组，根据GenBank中各自的18 S rDNA序列设计引物，建立了针对这3种艾美耳球虫的PCR鉴定方法，均扩增出了清晰条带，经比对，目的产物与GenBank中序列同源性在98.5%以上。2014年，石团员等[13]以中国家兔的肠艾美耳球虫为对象，根据18 S rRNA基因序列进行PCR扩增，经测序和比对，结果表明国内艾美耳球虫的18 S rRNA基因序列与法国和捷克分离的同种艾美耳球虫同源性分别为100%和96%。

2011年方素芳等[14-15]根据GenBank中发表的艾美耳属球虫18 S rDNA和5.8 S rDNA序列设计引物，通过PCR扩增内转录间隔区1(ITS-1)，分别以肠艾美耳球虫卵囊基因组和黄艾美耳球虫卵囊基因组为模板，扩增出了预期片段。2012年 ，顾小龙等[16]先是利用艾美耳属球虫18 S rDNA和5.8 S rDNA保守引物，PCR扩增3种兔球虫(大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和肠艾美耳球虫)ITS-1片段，随后又对国内5种兔球虫(大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、中型艾美耳球虫及穿孔艾美耳球虫)ITS-1序列进行扩增分析，与GenBank中序列同源性均在96.9%以上，表明ITS-1序列可作为兔球虫分子鉴定的遗传标记[17]。但由于ITS-1长度有限，不适合多重PCR等一些对遗传标记有长度要求的鉴别方法。鉴于此，许家园等[10]在2014年对3种常见兔艾美耳球虫的ITS全序列进行了PCR扩增和序列测定，并与GenBank中的相应序列比对，试验结果与Kvicerova等用18 S rDNA进行系统进化分析的结果一致，表明ITS序列可应用于兔球虫的系统进化研究，为兔球虫的分类鉴定、分子流行病学调查及相关研究奠定了基础。

2013年，闫文朝等[18]扩增了6种兔艾美耳球虫的ITS1-5.8S-ITS2完整序列。结果显示，每一种兔球虫的ITS1和ITS2序列都具有特异性。基于ITS1和ITS2的多态位点，他们建立了一种特异、敏感的多重PCR诊断方法，用于区分和鉴定斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫和黄艾美耳球虫这3种高致病性艾美耳球虫。此项研究为兔高致病性艾美耳球虫的临床鉴别和兔球虫病的群体遗传学研究提供了依据。

1.1.2套式PCR方法2011年，Oliveira U C等[19]根据11种兔艾美耳球虫各自的ITS1区序列设计特异性引物，建立了针对不同种球虫的套式PCR方法。经特异性试验验证，种间无交叉反应；敏感性试验结果显示，检测限从500 fg到1 pg不等，相当于0.8个～1.7个孢子化卵囊，且用3种不同品牌的扩增酶得到了一致的敏感性结果。这些敏感性好、特异性高的方法为兔艾美耳球虫流行病学调查提供了有效途径。

2014年，王云周等[20]对斯氏艾美耳球虫和中型艾美耳球虫的单卵囊基因组DNA进行随机扩增，然后用WGA(whole genome amplification)的产物作为模板，根据2种艾美耳球虫的ITS-1、18 S rDNA和23S rDNA设计特异性引物，建立了套式PCR方法。此方法可成功扩增出单卵囊基因，用这些单卵囊分离斯氏艾美耳球虫和中型艾美耳球虫的方法所进行的种类鉴定，与形态学鉴定结果完全一致，这表明套式PCR方法在艾美耳球虫单卵囊水平的分子生物学鉴定中具有实用性，该方法也可应用到其他寄生虫的鉴定。

1.1.3实时荧光定量PCR方法2015年，许家园等[21]针对肠艾美耳球虫ITS2序列设计1对特异性引物，以10倍倍比稀释的已知卵囊含量的肠艾美耳球虫DNA为模板进行SYBR Green Ⅰ real-time PCR的扩增和标准曲线的建立。结果显示，最低可检测1个卵囊含量的样品，与同属的大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和中型艾美耳球虫均不发生交叉反应。表明建立的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高，特异性强，重复性好，为快速检测肠艾美耳球虫提供了有效的方法。

1.2基于线粒体基因组(mtDNA)的鉴定技术

2012年，田思勤等[22]根据艾美耳球虫线粒体cytb基因设计保守引物，扩增兔6种艾美耳球虫cytb基因部分序列。根据获得cytb基因已知序列，设计长PCR引物，建立了套式PCR方法，获得了6种兔球虫mtDNA全序列。然后分析了6种艾美耳球虫线粒体基因组的基因结构、核苷酸组成、密码子使用情况等信息，以线粒体基因组蛋白质编码基因为标记，构建进化树，探讨兔艾美耳球虫在顶复门寄生虫中的进化位置。

2015年，刘国华等[23]针对肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、维氏艾美耳球虫和无残艾美耳球虫5种常感染家兔的艾美耳球虫的线粒体基因设计长PCR引物，建立了普通PCR鉴定方法并获得了这5种球虫线粒体基因组序列。通过对mtDNA的标记来进行群体遗传学和分子流行病学的研究，为分子诊断、预防和控制兔球虫做出贡献。

1.3基于顶质体基因组的鉴定技术

田思勤等[24]2014年采用刘国昌[25]报道的堆型艾美耳球虫rpoB和TufA基因的扩增引物，建立了针对兔艾美耳球虫rpoB和TufA基因的PCR技术，并利用生物学软件与GenBank中收录的顶复门寄生虫相关序列进行比对和进化分析。结果表明，扩增的两种兔艾美耳球虫rpoB和TufA基因片段的大小均相同，两种球虫rpoB和TufA基因种间的差异分别为6.8%和0.2%，rpoB基因差异相对较大，而TufA基因差异较小。因此，rpoB基因序列可以作为兔艾美耳球虫种间的遗传标记，用得到的rpoB基因序列为参考与其他顶复门寄生虫进行进化分析进一步证明了该结论，首次报道兔艾美耳球虫顶质体rpoB和TufA基因的部分序列，为兔艾美耳球虫的鉴定和进化分析提供参考依据，也为顶复门顶质体的深入研究奠定了基础。

2　不同分子生物学鉴定技术的评价

国内外用于鉴定兔球虫的分子生物学方法和技术有很多，不同技术都有各自的优缺点。崔平等人先后用普通PCR方法扩增ITS1序列，对肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和穿孔艾美耳球虫进行同源鉴定，同源性在96.9%以上。其中建立的针对肠艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和大型艾美耳球虫PCR方法的敏感性结果显示最低能检出27个孢子化卵囊。此种方法成本低，操作简便，但是扩增产物需要纯化测序，浪费时间，且易出现假阴性。套式PCR由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大的可能性，保证了反应的特异性，也极大的提高了PCR的敏感性，可以检出单个卵囊；但是套式PCR方法仍需要对结果进行电泳测定，费时费力，假阳性率高。实时荧光定量PCR通过荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使PCR扩增和终产物检测全处在封闭的条件下进行，从而具有实时监测、无污染、快速、灵敏、精确、特异等特点，其最主要的优势是能对待测样本起始PCR反应模板进行准确定量，极大的克服了普通PCR和套式PCR技术的不足。许家园建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法能够定量检测到含有一个卵囊含量的样本，敏感性和特异性都较高[21]。然而，SYBR Green染料的特异性还有待提高。

无论哪一种兔球虫的分子鉴定技术，其中DNA扩增引物的设计是关键，引物的特异性直接影响鉴定结果的准确性。目前文献报道最多的引物主要有两类，一类是根据球虫的保守序列设计的引物，最常选用的靶基因是核糖体基因，其中包括18 S、5.8 S、28 S rDNA。在18 S rDNA与5.8 S rDNA 之间以及5.8 S rDNA与28 S rDNA之间有内转录间隔区(ITS)。ITS序列具有功能上的保守性和进化上的时钟性[26]，被越来越多地用于物种分类和遗传进化关系的研究[27-28]；另一类是基于线粒体基因组的鉴定技术，mtDNA结构简单、稳定、以母系方式遗传，不受父本的影响；核苷酸歧异度大、进化速度快等特点，使得mtDNA在种间、种内、群体间和群体内具有广泛的多态性，常被作为可靠的遗传标记，应用于相近寄生虫种类鉴定[29-30]。COI基因属线粒体基因，其编码的COI为呼吸链的重要组分，普通存在于原核生物和真核生物细胞的线粒体中，其进化速度比核基因快10倍以上，故易受环境的影响及诱导而体现进化过程。

3　展望

分子生物学鉴定技术在检测和鉴定兔球虫种类方面的研究发展迅速，不断有新的技术方法出现，显示出较好的应用前景，分子生物学鉴定方法已部分取代了传统的形态学鉴定方法，应用于鉴定工作中。如TaqMan探针法实时荧光定量PCR，因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着广泛的应用，内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度，增加了其可靠性和实用性[31]。焦磷酸测序技术是一种新的DNA序列分析技术，其特点是操作简便、大通量、自动化，适合大量样本的快速检测，无须进行电泳、DNA序列无须荧光标记等，是一个理想的遗传分析技术平台。环介导等温扩增(LAMP)技术是一种新的恒温核酸扩增技术，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。该技术已被用于多种病原微生物的检测。相对于一般意义上的生物芯片，液相芯片具有高通量、高灵敏度、检测准确、重复性好、线性范围宽广等优势，液相芯片技术在生物医学工程领域具有广泛的应用。目前，应用这些技术对艾美耳球虫进行检测的方法还未见报道。相信未来实时荧光定量PCR、LAMP、液相芯片等方法的应用将克服现有兔艾美耳球虫检测方法存在的各种问题，为兔球虫物种鉴定、检测及流行病学调查提供更好的技术，满足口岸科学检疫把关的技术需求。

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Progress on Molecular Identification Techniques of Rabbit Eimeria spp.

FAN Chong-yu1,2,LÜ Ji-zhou2,YANG Xiao-ye1,WU Shao-qiang2

(1.College of Veterinary Medicine,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia，010018,China;2.InstituteofAnimalQuarantine,ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing,100029,China)

At present,11Eimeriaspecies that could infect rabbits were recognized.Coccidiosis could cause significant economic losses to rabbit industry worldwide.This paper reviewed the research progress on the molecular techniques adopted in rabbitEimeriaspecies identification,and discussed the advantages and the problems of these molecular methods.Besides,this paper also made a forecast on the tendency of molecular techniques in rabbitEimeriaspecies identification,which would be helpful in the diagnosis,prevention and control of rabbit coccidiosis.

rabbit;Eimeriaspp; molecular identification; technique

2016-03-08

国家科技支撑计划项目(2012BAK11B04)

樊翀宇(1990-)，女，内蒙古鄂尔多斯人，兽医硕士，主要从事动物寄生虫学研究。*通讯作者

S852.723

A

1007-5038(2016)08-0087-04