正交试验优选玉女煎多糖提取工艺研究

李生茂　刘琳 陈珍　王彪　万章平　陈小云

【摘 要】 目的：探索玉女煎多糖提取的最佳方法。方法：采用苯酚-硫酸显色测定玉女煎多糖的含量，采用L9（34）正交试验考察提取溶剂用量、提取时间和提取次数对玉女煎多糖提取的影响，并确定多糖最佳提取工艺。结果：玉女煎最佳提取工艺为12倍量的蒸馏水回流提取3次，每次30min。结论：该工艺稳定可行，可用于玉女煎多糖的提取。

【关键词】 玉女煎；多糖；正交试验；苯酚-硫酸法

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）22-0017-02

玉女煎首载于《景岳全书》[1]：“生石膏三、五钱，熟地三、五钱或一两，麦冬二钱，知母、牛膝各钱半，水一锺半，煎七分，温服或冷服”，用于“治水亏火盛，六脉浮洪滑大，少阴不足，阳明有余，烦热干渴，头痛，牙疼，失血等症”。玉女煎为滋阴润燥的代表方之一，临床常以其为基本方加减治疗糖尿病及并发症[2-7]，并取得良好效果。药理研究[8-10]证实，玉女煎及其加减对多种糖尿病动物模型有降血糖的作用、方中熟地[11-12]、麦冬[13-16]、知母[17-18]和牛膝[19-23]药材均含多糖类成分，且具有降血糖作用。实验采用正交实验设计优选了玉女煎多糖提取工艺，并采用硫酸-苯酚比色法测定其含量，以期为玉女煎多糖降血糖作用进一步研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津1750紫外分光光度计（日本岛津公司）；HH-2K4型恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；UP HW-IV-90T纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；Ohaus Discovery十万分之一电子分析天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）。

1.2 材料 熟地黄、石膏、麦冬、知母、牛膝均购于南充市便民大药房，经川北医学院附属医院李毅主任药师鉴定，均符合2010年版中国药典标准；水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 标准溶液的制备 取干燥至恒重的葡萄糖对照品适量，精密称定，加蒸馏水配制成浓度为0.2mg/ml的葡萄糖对照品储备溶液，4℃保存备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取玉女煎（按石膏∶地黄∶麦冬∶知母∶牛膝比例为15∶30∶6∶5∶5组方）约1g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入12ml蒸馏水，称定重量，回流提取3次，每次30min，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，合并三次滤液，即得。

2.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取葡萄糖对照品储备溶液0.5、1、1.5、2、2.5ml置10 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液2ml，加入1ml 6%的苯酚溶液，再加入5ml硫酸，90℃显色40min，取出，流水快速冷却至室温。以蒸馏水2ml按上述条件处理的溶液作为空白，在490nm处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程：A=11.671C+0.0665（R=0.9993）。结果表明，葡萄糖浓度在10～50μg/ml范围内的线性关系良好。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取玉女煎约1g，精密称定，按“2.1”制备供试品溶液，按“2.2”项下方法测定吸光度值，重复测定6次，吸光度值RSD为0.82%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取玉女煎6份，每份约1g，精密称定，按“2.1”制备供试品溶液，按“2.2”项下方法测定吸光度值，吸光度值RSD为4.15%，表明方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液按“2.1”项下方法显色后，分别在0、15、30、45、60 min 5个时间点测定吸光度，吸光度值的RSD为2.64%，表明样品在1h内稳定。

2.3.4 加样回收率试验 取玉女煎5份，每份约0.5g，精密称定，每份加入20mg葡萄糖，按“2.1”制备供试品溶液，按“2.1”项下方法测定吸光度值，计算回收率。结果表明葡萄糖的平均回收率为97.62%，RSD为3.98%。

2.4 正交试验 以多糖为指标，选用L9（34）正交表对提取次数（A）、提取时间（B）和提取溶剂用量（C）3个主要因素进行考察，每个因素拟设3个水平，见表1。按正交实验表1条件对玉女煎中多糖类成分进行提取，按“2.2”项下方法测定吸光度值，并计算其含量。由表2、3可知，影响玉女煎中多糖提取效果的因素大小顺序为A>C>B，即提取次数>溶剂用量>提取时间，提取次数对试验结果有极显著性影响（P<0.01），溶剂用量对试验结果有显著性影响（P<0.05）。结合直观分析，最佳提取方法为A3B1C3：即以12倍量的蒸馏水回流提取3次，每次30min。

2.5 验证试验 取玉女煎3份，每份约1g，精密称定，置于圆底烧瓶中，用确定的最佳提取条件进行提取，按“2.2”项下方法显色测定吸光度值，并计算多糖的含量，多糖的含量分别为101.228、98.572和104.403mg/g（平均含量为101.068mg/g），RSD为3.38%，表明该工艺稳定可行。

3 讨论

苯酚-硫酸法是测定多糖含量的常用方法之一[24]，其原理为多糖在浓硫酸作用下水解成单糖分子，并迅速脱水生成糠醛衍生物而与苯酚缩合生成有色化合物，该有色物具有紫外吸收且生成量与多糖浓度存在定量关系，故可用分光光度法在适当波长处测定吸光度，进而计算得到多糖含量。影响苯酚-硫酸法显色的因素较多[25]，前期采用单因素考察的方法对苯酚-硫酸法中显色的影响因素：6%苯酚用量（0.5、1、1.5ml）、硫酸用量（4、5、6ml）、显色温度（50、70、90、100℃）、显色时间（30、40、50min）进行了考察，结果表明6%苯酚1ml、硫酸5ml、温度90℃、水解时间40min显色最佳。

研究通过正交实验设计对玉女煎多糖提取工艺进行了优化，根据直观分析和方差分析可知，提取次数和提取溶剂用量对玉女煎多糖提取效果的影响最大，提取时间对多糖提取效果影响较小，从而确定玉女煎多糖最佳的提取工艺条件是12倍量的蒸馏水回流提取3次，每次30min。该工艺稳定可行，可用于玉女煎多糖的提取。

参考文献

[1] 明·张介宾.景岳全书[M]. 北京： 人民卫生出版社，1991：1267.

[2]范金茹.王行宽教授从心肝论治消渴病的经验[J].湖南中医学院学报，1998，18（4）：24.

[3]潘俊伟.玉女煎加减治疗非胰岛素依赖型糖尿病68例[J].中医药信息，1999，（5）：24.

[4]徐彦阁.玉女煎加减治疗2型糖尿病[J].医药论坛杂志，2009，30（9）：81-82.

[5]秦姝，李小娟.李小娟教授应用玉女煎治疗消渴病验案2则[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（4）：147-148.

[6]李靖.玉女煎加减治疗糖尿病性周围神经病变50例[J].四川中医，2002，20（10）：47.

[7]王李民.玉女煎加味治疗糖尿病皮肤瘙痒症102例[J].新中医，2009，41（11）：88.

[8]张状年，刘华东，徐玉田.玉女煎治疗小鼠实验性糖尿病的药理研究[J].中国中医药信息杂志，2000，7（5）：36-37.

[9]王静，王庆，王珍贞，等.中医不同治法对四氧嘧啶糖尿病模型大鼠的降糖作用[J].中西医结合学报，2010，8（8）：781-783.

[10]张鸣，孙必强.玉女煎加减方对高血糖大鼠的实验研究[J].中国实验方剂学杂志，2008，14（7）：54-56.

[11]符德学，侯艳.熟地黄、枸杞子和甜叶菊降糖作用的研究进展[J].焦作大学学报，2014，（2）：83-86.

[12]吴金环，顾红岩，喇孝瑾，等.地黄与熟地黄对糖尿病小鼠血糖血脂的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（8）：161-163.

[13]何陵湘.麦冬多糖降血糖作用的药效学观察[J].中国实用医药，2007，2（16）：48-50.

[14]黄琦，许家鸾.麦冬多糖对2型糖尿病血糖及胰岛素抵抗的影响[J].浙江中西医结合杂志，2002，12（2）：81-82.

[15]丘保华，李瑞满.麦冬多糖对妊娠糖尿病大鼠血糖的影响[J].暨南大学学报（医学版），2008，29（4）：367-369.

[16]毛讯.麦冬多糖对糖尿病小鼠的作用研究[J].中医临床研究，2013，5（17）：4-6.

[17]王靖，葛盛芳，陈琦，等.知母多糖降血糖活性研究[J].中草药，1996，27（10）：605-606.

[18]黄彩云，谢世荣，黄胜英.知母多糖对家兔血糖的影响[J].大连大学学报，2004，25（4）：98-99.

[19]奕海艳，高艳华，赵晓莲，等.牛膝多糖对糖尿病肾脏保护作用的研究[J].黑龙江医药科学，2008，31（1）：56-57.

[20]李海泉.牛膝多糖降糖作用实验研究[J].安徽医药，2004，8（5）：326-327.

[21]薛胜霞，金丽琴，贾东明，等.牛膝多糖衍生物对糖尿病大鼠血糖及血脂的影响[J].中国药学杂志，2009，44（2）：107-110.

[22]杨旭东，张杰，申梅淑.牛膝多糖对2型糖尿病大鼠脂肪分化相关蛋白表达的影响[J].药物生物技术，2010，17（4）：334-336.

[23]李金贵，袁楷，刘学忠，等.牛膝多糖对链佐星诱导性糖尿病小鼠的保护作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2010，24（1）：1-7.

[24]徐晓飞，陈健.多糖含量测定的研究进展[J].食品科学，2009，30（21）：443-448.

[25]徐晶，姜瑞平，夏光辉，等.苯酚-硫酸法测定金顶侧耳中多糖含量[J].安徽农业科学，2011，39（5）：2649-2651.

（收稿日期：2015.08.10）