金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测

魏晓敏（黑龙江省勃利县质量技术监督局，黑龙江勃利154500）



金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测

魏晓敏
（黑龙江省勃利县质量技术监督局，黑龙江勃利154500）

摘要：金黄色葡萄球菌中的毒素型菌株常会引起人中毒，且多发于气温较高的季节，易被污染的食物有肉馅、凉粉、剩饭、米酒、蛋及蛋制品等。常采用免疫学方法检测葡萄球菌肠毒素，该方法不仅敏感、特异，而且简便快速。其中反向乳胶凝集、酶联免疫吸附（ELISA）和胶体金法3种方法较为实用，常用于金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测。

关键词：金黄色葡萄球菌；肠毒素；快速检测

金黄色葡萄球菌中的毒素型菌株常会引起人中毒，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，多发于气温较高的季节，易被污染的食物有：加少量淀粉的肉馅、凉粉、剩饭、米酒、蛋及蛋制品、乳及乳制冷饮（如棒冰等）、含乳糕点等。金黄色葡萄球菌的致病力主要取决于其产肠毒素和凝固酶的能力，其产生的肠毒素可沾染食物，食者吃下约100ng的肠毒素即可出现食物中毒症状，主要是呕吐和腹泻。肠毒素可耐受100℃煮沸30min而不被破坏，常采用免疫学方法检测葡萄球菌肠毒素，不仅敏感、特异，且简便快速，其中反向乳胶凝集和酶联免疫吸附(ELISA)两种方法较为实用。

1　胶体金法

1.1适用范围

肉馅、凉粉、剩饭、米酒、蛋及蛋制品、乳及乳制冷饮（如棒冰等）、含乳糕点等食物易感染金葡菌。

1.2检测原理

采用双抗体夹心法，把抗金葡菌肠毒素特异性抗体包被在硝酸纤维素膜上，用于捕捉标本中的肠毒素，再用特异性抗体标记的免疫胶体金探针进行检测。

1.3操作步骤

第一，样品处理。一是固态食品：称取样品约2g，充分剪碎。加5mL生理盐水振荡10min，使内容物充分浸入。自然沉降或离心后取上清液作为样品检测液。二是液态食品：吸取0.1mL，加生理盐水0.4mL，混匀后作为样品检测液。第二，测定。取试剂一个，撕开外包装，吸取样品检测液，滴加3～4滴（约0.2mL）于试剂圆孔中，2min后开始观察结果，10min终止观察。

1.4结果判定

第一，阳性结果。试剂窗口“C”和“T”（对照和检测）处出现2条红色沉淀线为阳性，即有肉毒毒素检出。第二，阴性结果。试剂窗口“C”（对照）处出现1条红色沉淀线为阴性，即无肉毒毒素检出。第三，试剂失效。试剂窗口“C”和“T”（对照和检测）均无红色沉淀线，即试剂失效。

2　反向乳胶凝集法

2.1适用范围

反向乳胶凝集法适用于各种固体、液态易感染金葡菌的食品，肉馅、凉粉、剩饭、米酒、蛋及蛋制品、乳及乳制冷饮（如棒冰等）、含乳糕点等。

2.2检测原理

金黄色葡萄球菌肠毒素免疫的抗体血清经过纯化后与聚苯乙烯乳胶颗粒结合，这些乳胶颗粒与相应的肠毒素相互结合，就会产生相应的凝集反应。

2.3主要试剂

V型微孔板/10孔验血片，生理盐水，聚苯乙烯乳胶。

2.4操作步骤

第一，样品处理。称取样品约2g，充分粉碎，加5mL生理盐水振荡10min，使内容物充分浸出，自然沉降或离心5min，3 000r/min，取上清液作为样品检测液。第二，测定。取1L洁净板1块，滴加待检样品0.10mL，再滴加高免血清致敏乳胶0.01mL，以牙签或火柴杆混匀，在3min内判定结果。

2.5结果判定

如果有金葡菌肠毒素存在，会出现凝集反应，形成特定的网络结构，最终在微孔底部扩散形成一层沉淀。若不存在肠毒素或低于检测限，就不会形成网络结构，乳胶颗粒就会紧密地凝集在微孔底部。

2.6注意事项

第一，同时提供阴性质控，即与未经免疫的血清结合的乳胶颗粒。第二，食品的抽提物或菌落滤渡在5排V型微孔板中进行稀释，可以检测肉毒毒素最低检测限。

3　ELISA方法

3.1适用范围

ELISA方法适用于乳制品、巧克力、熏肉、鱼肉、生肉、熟猪肉、海产品。

3.2检测原理

将已知金葡菌肠毒素抗体包被于固态载体微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品（含有抗原）提取液的混合液，竞争培养后，在微孔板表面形成抗原抗体复合物。洗除多余抗体成分，加入酶标记抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量，从而推知被测样品中的抗原量。反应载体是微孔板中包被针对金黄色葡萄球菌肠毒素的特异性抗体。

3.3仪器与试剂

第一，器材。96孔微孔板，匀浆机或搅拌器，离心机≥3 000～3 500r/min，磁力搅拌器，pH计或pH试纸，涡旋振荡器，移液器100～1 000μL，计数板，0.2μm过滤器，透析袋，酶标仪。

第二，试剂。ELISA试剂盒。生肉提取试剂盒（将每个试剂瓶加入400μL蒸馏水，分装成20μL/瓶。储存在-30℃～-15℃条件下）。提取缓冲液（可选），Na2HPO4·2H2O35.6g或KH2PO46.8g，溶解于1 000mL水中。pH调试剂，NaOH（6mmol/L），HCl（6mmol/L）。聚乙二醇（MW>17 000），将30g聚乙二醇溶解于100mL蒸馏水中，轻微加热。阳性质控稀释液按照1∶50的比例用蒸馏水稀释阳性质控（40μL阳性质控加2mL蒸馏水），混合均匀。稀释洗涤缓冲液按照1∶20的比例用蒸馏水稀释洗涤缓冲液。混合并加至洗涤设备。发色剂和底物混合液将50μL发色剂和50μL底物混合。

3.4操作步骤

第一，固态食品。把25g食物样品加入25mL提取缓冲液中，用混合器混合均匀，若过于黏稠，加入提取缓冲液或蒸馏水。将悬浊液室温下（18℃～25℃）放置30min，便于毒素扩散。离心分离（15min，3 000r/min）或过滤残渣，取上清液，调pH值至7.0～7.5。如果有沉淀，进行再次离心分离取上清液，备用。第二，液态和罐装菌类食品。直接用罐中液体不需要提取，测定前确保pH值在7.0～7.5。第三，熟猪肉和海产品。采取固态食品提取步骤，以蒸馏水替代提取缓冲液。第四，生肉。为了防止假阳性结果，要对生肉另行提取。按照固态食品一般步骤在室温下提取。pH值至7.0～7.5，每1mL提取液加入20μL生肉提取液1，均质，室温孵育10min （18～25℃）。再加入20μL生肉提取液2，均质，室温孵育10min，调pH值至7.0～7.5，过滤，取滤液备用。

参考文献：

［1］王世平.食品安全检测技术［M］.北京：中国农业大学出版社，2015：92.

［2］师邱毅.食品安全快速检测技术及应用［M］.北京：化学工业出版社，2015：38.

［3］曾庆祝.食品质量与安全检测［M］.北京：中国质检出版社，2015：45.

Rapid Detection of Staphylococcus Aureus Enterotoxin

WEI Xiao-min
(Boli County, Heilongjiang Province Qualityand Technical Supervision, Boli 154500, China)

Abstract:Staphylococcus aureus toxins strain often causes poisoning and mainly occurs in the high temperatures of the season, foods easily contaminated are meat, jelly, leftovers, rice wine, eggs and egg products.Immunological methods are often used to detect staphylococcal enterotoxin, which is sensitive, specific, simple and fast.Wherein the reverse latex agglutination method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method and colloidal gold method are more practical, which are commonly used in rapid detection of staphylococcus aureus enterotoxin.

Key words:Staphylococcus aureus; Enterotoxin; Rapid detection

作者简介：魏晓敏（1973-），女，黑龙江勃利人，高级工程师，主要从事食品检验工作与研究。

收稿日期：2015-12-25

中图分类号：R155.3+

文献标志码：A

文章编号：1674-8646（2016）02-0018-02