定量检测HCMV pp67 m RNA快速诊断人巨细胞病毒活动性感染

钟 峰，赵 俊，张业婷，姚 瑶，王明丽

定量检测HCMV pp67 m RNA快速诊断人巨细胞病毒活动性感染

钟 峰，赵 俊，张业婷，姚 瑶，王明丽

目的建立实时荧光定量逆转录PCR（Real time RT-qPCR）方法，检测外周血中人巨细胞病毒（HCMV）pp67 mRNA的拷贝数，用于临床快速诊断HCMV活动性感染。方法采用RT-qPCR测定86份癌症患者外周血标本中的HCMV pp67 mRNA拷贝数，并与HCMV pp65抗原血症检测及HCMV分离培养的实验结果进行比较。结果86例癌症患者中，HCMV病毒分离检测阳性率3.49%（3例）；实时荧光定量RT-PCR检测阳性率17.44%（15例），灵敏度为100%，特异性为85.54%；HCMV pp65抗原血症检测阳性率为10.47%（9例），灵敏度为66.7%，特异度为92.8%。两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。通过受试者工作特征（ROC）曲线分析，RT-qPCR检测每2×105个外周血白细胞中HCMV拷贝数的截断点值为201.5；此病毒拷贝数可作为诊断HCMV活动性感染的参考阈值。结论应用RT-qPCR检测HCMV活动性感染，灵敏度高、特异性好；并能够为抗病毒治疗供重要的参考依据。

人巨细胞病毒；pp67 mRNA；实时荧光定量RTPCR；活动性感染

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）属疱疹病毒β亚科，为双链DNA病毒。在人群中感染普遍，我国人群感染率高达90%以上［1］。HCMV在原发性感染后会潜伏于人体组织内并形成终身感染［2］。通常对免疫正常人无危害，但对免疫功能低下人群可造成致死性损伤［3-4］。研究［5］显示，在肿瘤组织中检测到HCMV核酸及抗原，表明HCMV感染可能与肿瘤发生发展相关。HCMV pp67是由UL65基因编码的一种病毒结构性皮层蛋白，是HCMV复制晚期表达的基因产物。因此，pp67 mRNA的检出能够表明病毒呈活动性感染状态［6］。临床研究［7］表明，目前对HCMV早期活动性感染的诊断，远不能达到临床需求，存在盲目用药或药物毒性反应发生等不良反应。为了更好地预防和控制HCMV活动性感染，该研究以HCMVpp67 mRNA为靶基因，定量检测HCMV基因拷贝数，目的是建立一个更适用于临床需求的科学检测方法，为临床快速诊断与抗病毒治疗用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与病毒株人胚成纤维细胞株由安徽医科大学微生物教研室自行制备，PCR鉴定排除疱疹病毒污染。HCMV AD169毒株由复旦大学医学院微生物教研室提供，本实验室保存。

1.2 病例资料收集2015年1月5日～2月13日安徽医科大学第一附属医院老年科癌症患者外周血标本86份，使用EDTA-K2抗凝管收集患者静脉血3 ml，分别用于实时荧光定量PCR及pp65抗原血症检测和病毒分离。

1.3 实验试剂与仪器DMEM培养基、小牛血清（美国Gibco公司）；mRNAiso Blood抽提试剂盒、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒、pMD18-TVector（日本Takara公司）；HCMV Brite Trubo Kit（荷兰IQ公司）；DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒（杭州爱思进生物技术有限公司）；SYBR Green I Master、荧光定量PCR LightcyclerⓇ480仪（瑞士Roche公司）。

1.4 PCR引物以GenBank中选择病毒复制所必需的在各株间具有高度保守性的HCMV晚期基因（pp67基因）序列进行引物设计，由上海Invitrogen公司合成。pp67上游引物为5′-AAAAGAGACCGCGTCTCTGG-3′，下游引物为5′-TAGAGCCTGAGATGATGATG-3′，扩增产物为202 bp。以HCMV Town株的UL144基因为模板合成PCR引物，UL144上游引物为：5′-TCGTATTACAAAAAGCGGAGAGGAT-3′，下游引物为5′-ACTCAGACACGGTTCCGTAA-3′，扩增产物为736 bp。

1.5 病毒分离将第5～7代的HF细胞制成1× 105个/ml细胞悬液接种于细胞瓶，置5%CO237℃温箱培养。抗凝血标本处理：将抗凝管采集的患者静脉血3 ml静置1 h后，于4℃2 000 r/min离心10 min，取离心后得到的白细胞0.2 ml接种至已长成单层的HF细胞，37℃孵育1 h，更换维持液，置5%CO2孵育箱37℃培养。接种标本的细胞每周传代1次，每天通过倒置显微镜观察细胞有无CPE。

1.6 HCMVpp65抗原血症应用荷兰IQ公司生产的HCMV Brite Turbo Kit（L14041）检测血标本中白细胞HCMV pp65抗原。试剂盒检测步骤：使用裂解液去除红细胞，1 000 r/min离心10 min收集白细胞；调整细胞数为2×105/ml，制备涂片；固定破膜；加入一抗，孵育60 min；加入二抗，孵育30 min；封片，荧光显微镜下读片，判读结果。

1.7 荧光定量RT-PCR方法建立

1.7.1标准品的构建 采用mRNAiso Blood抽提试剂盒，从感染HCMV AD169株的细胞内提取总RNA，RT-PCR扩增并制备pp67基因的目的片段，扩增产物经过回收纯化后与pMD18-T载体连接成重组质粒，转化到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，用AxyPrep小提质粒试剂盒提质粒，用PCR对重组质粒进行鉴定。根据重组质粒的光密度（optical density，OD）值换算出重组质粒的拷贝数，梯度稀释后作为标准品。

1.7.2荧光定量RT-PCR反应条件 实时荧光定量PCR反应条件（循环参数）：95℃5 min；95℃10 s，60℃20 s 72℃20 s（40循环）40℃10 s。20μl总体积最适反应体系为：引物0.5μmol 1μl、SYBER Green IMaster 10μl、H2O 6μl、DNA模板2.0μl。

1.7.3灵敏度及稳定性试验 以制备的标准品为模板，进行10倍系列梯度稀释，取8个稀释度的mRNA按反应条件和体系进行荧光定量RT-PCR，以不同模板浓度的扩增曲线所在的Ct值确定此方法的灵敏度。并以批内每个稀释度的2个复孔进行平行试验。

1.7.4特异性试验 分别对与HCMV同种属的其它疱疹病毒如HSV1、HSV2和VZV进行RNA抽提并作为模板，并设立正常细胞对照及空白对照，在相同的反应体系和扩增参数条件下进行实时荧光定量RT-PCR。鉴定该方法的特异性。

1.7.5标准曲线的制备 将标准品从4.08×107拷贝数/μl依次10倍系列稀释，共计7个浓度梯度。每个稀释度进行2次重复，以平均Ct值为横坐标，模板浓度的对数为纵坐标自动生成标准曲线。

1.8 结果判定病毒分离结果着重在镜下观察接种标本后的HF细胞单层上在4周内有无出现HCMV特征性CPE；对CPE阳性者，取样进行PCR，检测HCMV UL144基因。阳性的PCR产物经测序比对后，方可确认为病毒分离阳性；HCMV pp65抗原血症检测阳性结果的认定为，在荧光显微镜下观察到HCMV pp65阳性细胞的细胞核呈均匀的苹果绿荧光，以2×105个多形核白细胞中pp65抗原阳性细胞≥1个为阳性；全血HCMV实时荧光定量PCR检测结果以全血HCMV mRNA拷贝数≥最低检测限为阳性。

1.9 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计数资料进行χ2检测。ROC曲线及最佳截断点评估荧光定量RT-PCR诊断的价值，以曲线下面积表示。

2 结果

2.1 病毒分离CPE观察及分离株鉴定

2.1.1细胞CPE观察 镜下观察在86份接种了临床标本的细胞单层上，发现病毒分离阳性的细胞明显变圆、肿胀、折光性增强、形态及排列不规则、细胞内颗粒增多，呈典型的巨细胞病毒特征性CPE现象。见图1。

2.1.2分离株鉴定 本次实验成功分离出3例HCMV临床病毒株。PCR检测阳性产物由通用生物系统（安徽）有限公司对分离的病毒株进行UL144基因鉴定，测序结果经过BLAST比对显示，被测基因片段序列与GenBank报道Town株序列匹配达98%，确认为HCMV临床病毒分离株。见图2。

2.2 HCMVpp65抗原血症检测86份样本中，检测HCMV pp65抗原血症阳性患者9例（阳性率10.47%），荧光显微镜下观察HCMV pp65阳性细胞核呈现出均匀绿色荧光（图3B），阳性细胞数≥1/2 ×105外周血白细胞判为阳性，阳性标准品对照由试剂盒提供（图3A）。红色荧光为伊文斯兰衬染细胞激发出的红光。

2.3 HCMVpp67mRNA荧光定量RT-PCR方法的建立本次实验成功建立了HCMV pp67 mRNA荧光定量RT-PCR方法，构建了HCMV的阳性标准品，制作了标准曲线，扩增效率达到1.786，反应灵敏度达到4.08×10 copies/μl，对于已构建的阳性样本为特异性扩增，而阴性对照物无特异性扩增，组内与组间重复性良好。

2.3.1灵敏度及稳定性试验 实时荧光定量RTPCR检测HCMV pp67 mRNA扩增曲线，呈典型的S形上升曲线，模板在每两个相邻的稀释度之间的Ct值相差约3个单位，实验检测模板最低含量限度为40.8拷贝数/μl。每个稀释度重复的平行对照Ct值基本一致，表明实验体系的稳定性良好，见图4。

2.3.2特异性试验 检测所构建方法的特异性，对HCMV、HSV1、HSV2、VZV、正常细胞对照的DNA模板进行荧光定量RT-PCR，非靶目的DNA对照组无荧光曲线的增长，只有HCMV病毒对照组出现阳性扩增曲线，此结果显示该方法有良好的特异性见图5。

2.3.3标准曲线的制备 分别用10倍系列稀释的标准品作为模板，以模板拷贝数的对数作为横坐标。以平均Ct值为纵坐标，生成出一条直线型的标准曲线：方程为Y=-3.97log（X）+42.65，斜率为-3.970，扩增效率为1.786，见图6。

2.4 HCMVpp67mRNA荧光定量PCR与pp65抗原血症检测结果比较对86份患者全血进行检测，HCMV pp67 mRNA荧光定量PCR阳性为15例，阳性率17.44%。HCMV pp65抗原血症检测阳性9例，阳性率10.47%。这两种方法所得结果符合率为90.70%。两种检测方法结果之间进行统计学处理，应用校正χ2检验公式，即HCMV pp67mRNA荧光定量PCR检测阳性率与pp65抗原血症检测阳性率相比，差异有统计学意义（χ2=30.308，P＜0.01）。

2.5 HCMVpp67mRNA荧光定量RT-PCR检测结果与病毒分离的比较病毒分离阳性样本（3例）中RT-qPCR检测全为阳性，RT-qPCR检测阴性样本（71例）中病毒分离未见阳性。RT-qPCR检测方法灵敏度为100%，特异性为85.54%，阳性预测值（PPV）0.20，阴性预测值（NPV）1.00，差异有统计学意义（χ2=9.372，P＜0.05）。

2.6 HCMV荧光定量RT-PCR最佳诊断阈值的确定以灵敏度为纵坐标，误诊率（1-特异度）为横坐标，在SPSS17.0软件上作ROC曲线并计算曲线下面积。HCMV荧光定量RT-PCR检测方法的ROC曲线下面积为0.823，准确性较好。以Youden指数接近1时对应的数值为cutoff值，得到cutoff值为201.5拷贝数/2×105PBLs，提示此方法检测的cutoff值可作为临床诊断HCMV活动性感染的指标。见图7。

3 讨论

HCMV基因复制具有时序性，分为立即早期（IE）、早期（E）和晚期（L）基因，活动性感染的重要标志就是晚期基因的出现。目前pp65抗原血症检测被广泛认为是HCMV活动性感染的“金标准”［8］。但是这种方法也存在一些缺点：实验工作量多，耗时长，观察结果需要专业熟练的技术人员，技术不能够标准化，精确的临床确诊参考阈值仍然没有确定。HCMV pp67 mRNA是病毒复制晚期表达的基因，文献［9］报道pp67 mRNA检测与IE基因比较，前者能够更好地反映HCMV在体内活动性感染。

本研究对86份癌症患者外周血白细胞样本进行检测。以荧光定量RT-PCR和HCMV pp65抗原血症检测结果相比较，二者符合率为90.70%。通过ROC曲线分析，荧光定量RT-PCR检测的cutoff值为201.5拷贝数/2×105PBLs，对应灵敏度为73.33%，特异度为72.26%。但是由于标本数量过少及检测方法有待进一步优化，实验数据有待进一步提高。

恶性肿瘤现已成为我国人口死亡的主要原因之一，现主要治疗手段有手术、化疗和放疗，而在杀死癌细胞的同时也会杀死大量正常细胞，导致肿瘤患者免疫功能大大降低，并由此诱导HCMV再激活而导致活动性感染。与此同时，HCMV活动性感染对肿瘤细胞周期的影响、参与肿瘤细胞的凋亡及调节肿瘤细胞的免疫逃逸，对肿瘤的发展起到重要的作用，并能够增加肿瘤的恶性程度［10-11］，目前研究［12-14］表明，HCMV感染与肿瘤细胞数量及恶性程度有关。将抑制HCMV复制及调节病毒基因编码的mRNA表达作为肿瘤治疗的一个新靶目标，能够拓展肿瘤治疗的一个新领域，为临床治疗肿瘤提供新的思路，同时也能预防并减少因HCMV活动性感染造成器官损伤，包括肺炎、肠炎、视网膜炎等终末器官综合征。

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The quantitative detection of human cytomegalovirus pp67 mRNA in rapid diagnosis of active human cytomegalovirus infection

Zhong Feng，Zhao Jun，Zhang Yeting，et al
（Dept of Microbiololgy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the detection of HCMV pp67mRNA in peripheral blood by RT-PCR for the diagnosis of HCMV active infection.MethodsThe peripheral blood samples of 86 postoperative cancer patients were measured by the real-time quantitative PCR（RT-PCR）.The resultswere compared with pp65 antigenemia test and HCMV virus isolation.ResultsIn the 86 cancer patients，15 patientswere positive in pp67mRNA RT-PCR，9 patientswere positive in pp65 antigenemia test，3 patients were positive in virus isolation.The sensitivity of HCMV pp67 mRNA RT-PCR was 100%，and the specificity was 87.9%，the sensitivity of HCMV pp65 antigenemia was 66.7%and the specificity was 92.8%，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The result of ROC curve analysis showed the cutoff value of real-time RT-qPCR is 201.5copies/2×105Peripheral blood leucocyte cells，these hint this virus content can be used as a reference threshold of HCMV active infection.ConclusionThe sensitivity and specificity of the RT-qPCR are good，which can provide fast and accurate diagnosis of HCMV active infection，and lay the basis for clinical antiviral treatment.

human cytomegalovirus；pp67 mRNA；Real time RT-PCR；active infection

R 373.9

A

1000-1492（2016）03-0324-05

时间：2016/1/28 14：23：10 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.006.html

2015-12-25接收

国家自然科学基金（编号：30872253）；安徽省教育厅自然科学重大研究项目（编号：KJ2012ZD08）

安徽医科大学微生物学教研室，合肥 230032

钟 峰，男，硕士研究生；

王明丽，女，教授，硕士导师，责任作者，E-mail：1952987441 @qq.com