野生蓝莓果渣中花色苷提取工艺研究

陈亮，辛秀兰，*，王晓杰，李晔，陈振娅，李燕（.北京电子科技职业学院生物工程学院，北京0009；.北京化工大学生命科学与技术学院，北京0009）



野生蓝莓果渣中花色苷提取工艺研究

陈亮1，辛秀兰1，*，王晓杰1，李晔1，陈振娅2，李燕1
（1.北京电子科技职业学院生物工程学院，北京100029；2.北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029）

摘要：以野生蓝莓果渣为原料，采用溶剂浸提法提取花色苷，采用pH示差法对花色苷含量进行测定，试验结果表明：果渣中花色苷的提取工艺为甲醇的浓度为60 %，盐酸浓度为0.3 %，提取温度为30℃，提取时间为2 h，此条件下花色苷的提取率最高，可达231.49 mg/100 g。

关键词：野生蓝莓；果渣；花色苷；提取

蓝莓（Blueberry），又称为蓝浆果、越橘，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium.spp）为一种多年生落叶或常绿灌木，矮脚野生[1]。全世界分布的越橘属植物可达400余种，原产和主产于美国又被称为美国蓝莓。我国主要产在大兴安岭和小兴安岭林区尤其是大兴安岭中部，而且都是纯野生的。大量研究报道，常食蓝莓果可以增强视力，抗氧化、延缓衰老，增强心脏功能，并可以预防炎症和癌症[2]。蓝莓已被列入世界“第三代新兴水果”的行列，也被国际粮农组织归为人类5大健康食品之一，市场前景广阔。

花色苷（Anthocyanin），是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到蓝等不同颜色。花色苷是类黄酮—以黄酮核为基础的一类物质中能呈现红色的一族化合物。由于食品加工业中常用的人工合成的红色染料有毒性和致癌的可能性，花色苷的应用越来越受到关注。花色苷是一类天然无毒的食品添加剂，另外，花色苷还具有很多功效，如抗氧化、清除自由基作用，减少低密度脂蛋白（LDL），抗突变、抗肿瘤，改善视力作用等[3-4]。

蓝莓果在种植加工中，由于储存不当或初级加工废弃会产生大量的坏果、烂果或果渣等废弃物，但是这些废弃物中含有大量的具有生物活性的酚类成分，如花色苷、鞣花酸等，尤其是花色苷成分都存在于果皮里，经榨汁后常被废弃，造成大量的浪费，因此，选择合适的提取工艺，获得附加值高的天然产物或产品，有利于废物再利用和环境保护。本试验采用废弃的野生蓝莓果渣为原料提取花色苷，研究溶剂浸提法提取花色苷的最佳工艺条件，包括最适温度、最适溶剂和酸浓度、提取温度、提取时间、提取次数等[5-7]。

1材料与方法

1.1材料

野生蓝莓果渣：吉林农业大学。

1.2试剂

甲醇、浓盐酸、三氟乙酸、柠檬酸、乙酸、氯化钾、乙酸钠，均为分析纯，购自北京化工厂。

1.3仪器

Cary50紫外可见分光光度计：美国瓦里安公司；DHZ-D全温振荡器：江苏太仓机械有限公司；WF万能粉碎机：江阴市康和机械制造有限公司。

1.4方法

1.4.1 pH示差法测定花色苷的含量

花色苷存在的4种形式：蓝色的酮式（脱水）碱、红色的鎓正离子、无色的甲醇假碱和查尔酮式。花色苷只有在酸性介质中的稳定的，因此只测定pH小于7条件下花色苷吸光值的变化。

在单一pH下测定花色苷，会受到其他成分的干扰，在溶质介质中，花色苷的结构会随pH的改变而改变，而干扰物质的特征光谱不随pH的改变而改变。

pH为1.0时，花色苷以红色的2-苯基苯并吡喃的形式存在，pH为4.5时，花色苷以无色的甲醇假碱的形式存在，选择pH为1.0和4.5为测定条件。在两个不同的pH下，花色苷溶液的吸光度的差值与花色苷的含量成正比例[8-9]。

氯化钾缓冲溶液（0.025 mol/L，pH=1.0）配制：1.86 g的氯化钾溶于980 mL的蒸馏水中，加入少量浓盐酸调pH至1.0，再用蒸馏水定容至1 L，混匀即可；

乙酸钠缓冲溶液（0.4 mol/L，pH=4.5）配制：54.43 g的三水合乙酸钠溶于960 mL的蒸馏水中，加入少量浓盐酸调pH至4.5，再用蒸馏水定容至1 L，混匀即可。

样品的测定取1 mL的提取液分别用pH=1.0和pH=4.5的缓冲液稀释定容至两个10 mL比色管中，放置15 min达平衡后，分别在520 nm和700 nm处测定其吸光度，并根据下述公式计算各样品总花色苷的含量，每个样品平行做3次。

1.4.2蓝莓果渣花色苷的提取

蓝莓果渣干燥粉碎，称取1 g蓝莓果渣粉，加入适量提取溶剂，在一定条件下进行浸提，真空抽滤，得到提取液，置于容量瓶定容，再用pH示差法进行花色苷含量的测定。

1.4.3花色苷提取单因素试验设计

称取1 g蓝莓果渣粉，加入提取溶剂进行浸提，对果渣粉的目数、提取溶剂、甲醇浓度、添加酸种类、酸浓度、料液比、提取温度、提取时间、提取次数和振荡转速设计单因素试验进行考察，并采用pH示差法进行测定。

1.4.4花色苷提取正交试验设计

根据单因素试验的结果确定花色苷提取的正交设计表，选择出对花色苷提取率影响较大的因素为甲醇浓度（A）、盐酸浓度（B）、提取温度（C）、提取时间（D），采用四因素三水平的进行正交试验，优化果渣中花色苷的提取工艺，确定最佳提取工艺参数。正交试验因素水平表见表1。

表1正交试验因素水平表Table 1 The extraction experiments of orthogonal design

2结果与讨论

2.1溶液浸提法单因素试验结果

2.1.1蓝莓果渣目数对花色苷提取率的影响

蓝莓果渣目数对花色苷提取率的影响见图1。

图1果渣目数对提取率的影响Fig.1 The influence of mesh number on anthocyanin extraction

分别取20、40、60、80、100目的果渣，加入提取溶剂提取，其他提取参数相同，由图1可知，果渣目数小，果渣颗粒较大，花色苷不易从果渣中溶出，当果渣目数较大时，果渣颗粒微小，不易过滤，滤纸上花色苷残留吸附严重，故当果渣目数为60目时，果渣颗粒合适，易于过滤且适于花色苷溶出，花色苷的提取率最高。

2.1.2提取溶剂对花色苷提取率的影响

提取溶剂对花色苷提取率的影响见图2。

图2提取溶剂对花色苷提取率的影响Fig.2 The influence of extraction solvent on anthocyanin extraction

采用60目的果渣4份，分别加入水、甲醇、乙醇和丙酮等不同提取溶剂进行提取，其他提取参数相同，由图2可知，花色苷在水中溶出提取不完全，颜色较浅，甲醇、乙醇和丙酮的提取率较高，其中，甲醇的提取率最高。

2.1.3甲醇浓度对花色苷提取率的影响

甲醇浓度对花色苷提取率的影响见图3。

图3甲醇浓度对花色苷提取率的影响Fig.3 The influence of methanol concentration on anthocyanin extraction

配制不同甲醇浓度的提取液，分别进行花色苷的提取，其他提取参数相同，由图3可知，水中花色苷提取率较低，随着甲醇浓度逐渐提高，花色苷的含量逐渐增加，当甲醇浓度达到60 %时，花色苷的提取率基本变化不明显，故提取溶剂选择60 %的甲醇水溶液。

2.1.4不同酸对花色苷提取率的影响

不同酸对花色苷提取率的影响见图4。

图4不同酸对花色苷提取率的影响Fig.4 The influence of acid on anthocyanin extraction

向4份60 %的甲醇溶液提取剂中分别加入三氟乙酸、柠檬酸、乙酸、盐酸，进行花色苷的提取，其他提取参数相同，由图4可知，使用三氟乙酸时，花色苷的提取率最高。但考虑到试验成本和操作的复杂程度，且盐酸的提取率和三氟乙酸相差不大，故采用盐酸为最佳添加酸。

2.1.5盐酸浓度对花色苷提取率的影响

盐酸浓度对花色苷提取率的影响见图5。

分别配制不同盐酸浓度的60 %的甲醇提取溶剂，其他提取参数相同，由图5可知当采用0.2 %的60 %的酸化甲醇水溶液时，花色苷的提取率最高，故提取溶剂中添加酸的含量为0.2 %（体积分数）。

图5盐酸浓度对花色苷提取率的影响Fig.5 The influence of hydrochloric acid concentration on anthocyanin extraction

2.1.6料液比对花色苷提取率的影响

料液比对花色苷提取率的影响见图6。

图6料液比对花色苷提取率的影响Fig.6 The influence of ratio of solid to liquid on anthocyanin extraction

分别采用不同的料液比分别对果渣中的花色苷进行提取，其他提取参数相同，由图6可知，当料液比为1∶30（g/mL）时，花色苷的提取率最高，1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）的料液比对花色苷的提取率影响不大，为了节约溶剂成本，确定1∶20（g/mL）为最佳料液比。

2.1.7提取温度对花色苷提取率的影响

提取温度对花色苷提取率的影响见图7。

图7提取温度对花色苷提取率的影响Fig.7 The influence of extration temperature on anthocyanin extraction

将果渣和提取溶剂按1∶40（g/mL）的料液比混合，设定不同温度进行提取，其他提取参数相同，由图7可知，20℃时提取率最低，而当温度设定到40℃时，溶剂部分挥发，且花色苷对热敏感，有少量降解，当提取温度为30℃时花色苷的提取率最高，故提取温度控制在30℃。

2.1.8提取时间对花色苷提取率的影响

提取时间对花色苷提取率的影响见图8。

图8提取时间对花色苷提取率的影响Fig.8 The influence of extration time on anthocyanin extraction

称取6份相同质量的果渣，按料液比为1∶20（g/mL）加入提取溶剂，设定温度设为30℃，分别进行不同时间的提取，其他提取参数相同，图8表明，当提取时间为2 h时，花色苷的提取率达到最高，随着时间增加，花色苷有少量减少，但变化不明显，故提取时间选择2 h。

2.1.9提取次数对花色苷提取率的影响

提取次数对花色苷提取率的影响见图9。

图9提取次数对花色苷提取率的影响Fig.9 The influence of extration times on anthocyanin extraction

称取3份相同质量的果渣，分别进行1次、2次、3次的提取，其他提取参数相同，由图9可知，提取次数越多，提取率越小，且第1次和第2次差别很大，第2次远小于第1次，花色苷在第1次提取时得到的最多。为了节约时间和成本，试验采用提取1次的方法。

2.1.10振荡转速对花色苷提取率的影响

振荡转速对花色苷提取率的影响见图10。

图10转速对花色苷提取率的影响Fig.10 The influence of oscillation speed on anthocyanin extraction

设定不同的振荡转速，进行花色苷的提取，其他提取参数相同，由图10可知当提取温度为30℃，提取时间为2 h时，提取次数为1次，酸浓度为0.2 %，甲醇浓度为60 %的提取溶剂，料液比为1∶20（g/mL）时，转速对花色苷的提取效率影响不大。

2.2正交试验优化溶液浸提法提取工艺结果

根据单因素试验各因素对提取效果的影响以及取值的范围，设计正交试验确定最佳提取条件，正交试验结果及分析见表2。

表2正交设计试验结果Table 2 The extraction results of orthogonal design

由表2结果可知，各因素影响花色苷提取率的主次关系为A>B>D>C，最佳的提取条件为A3B3C2D1或A3B3C3D1，即当甲醇的浓度为60 %，盐酸的浓度为0.4 %，提取温度为30℃，提取时间为2 h，花色苷的提取率最高，达到219.40 mg/100 g。

对由k值分析得出的最佳方案进行验证试验，试验结果表明在甲醇的浓度为60 %，盐酸的浓度为0.3 %，提取温度为30℃，提取时间为2 h，花色苷的提取率最高，为231.49 mg/100 g，因此最佳提取条件为A3B2C2D1。

蓝莓花色苷具有抗氧化、清除自由基、抗癌和改善视力等生物活性，具有巨大的保健功能。李颖畅等研究发现，蓝莓花色苷使高脂血症大鼠血脂水平和动脉粥样硬化指数（AI）显著降低，血清和肝脏T-AOC、SOD和GSH-Px活性明显增强，MDA的生成量显著减少[10-11]。

3　结论

以蓝莓果渣为原料提取花色苷的最佳提取工艺条件为，甲醇浓度60 %，盐酸浓度0.3 %，提取温度30℃，提取时间为2 h，提取次数为1次，花色苷的提取效率最高，为蓝莓果渣的废物利用、变废为宝，规模化提取生产提供工艺参数。

参考文献：

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Study on Extraction of Anthocyanin from Wild Blueberry Pomace

CHEN Liang1，XIN Xiu-lan1，*，WANG Xiao-jie1，LI Ye1，CHEN Zhen-ya2，LI Yan1
（1. College of Bioengineering，Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China；2. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）

Abstract：Wild blueberry pomace was used as the raw material to extract anthocyanin by solvent extraction，and the anthocyanin content was determined by pH-differential method. The results demonstrated that the optimum process conditions for anthocyanin extraction was methanol concentration of 60 %，concentration of hydrochloric acid of 0.3 %，extraction temperature of 30℃and extraction time of 2 h. The total anthocyanin content was 231.49 mg/100 g.

Key words：wild blueberry；pomace；anthocyanin；extract

收稿日期：2014-12-01

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.014

*通信作者：辛秀兰（1968—），女（汉），教授，博士，研究方向：小浆果资源的研究与推广。

作者简介：陈亮（1986—），男（汉），讲师，博士，研究方向：小浆果产品的研究与开发。

基金项目：北京市教委科技计划面上项目（KM201510858001）；公益性行业（农业）科研专项（201103037）；促进人才培养综合改革项目“色谱技术在天然活性物质筛选中的应用”；北京电子科技职业学院教育教学改革项目；促进人才培养（师资队伍建设）-校内专业教学团队和优秀人才培养计划项目（CJRC-SZDW-2015/001）