正交试验法优化莲子壳中原花青素的提取工艺

童锡迪，彭红（江西中医药大学，江西南昌330004）



正交试验法优化莲子壳中原花青素的提取工艺

童锡迪，彭红*
（江西中医药大学，江西南昌330004）

摘要：试验优选了莲子壳中原花青素的最佳提取工艺。以原花青素的提取率为指标，采用单因素试验和正交试验法，考察乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4因素对原花青素提取率的影响，优选其最佳提取条件。结果表明，优选出的最佳提取工艺为：提取溶剂50 %乙醇，料液比1∶10（g/mL），提取温度65℃，提取时间3 h。该提取工艺操作简单，稳定性好，适用于工业化生产。

关键词：莲子壳；原花青素；提取工艺；正交试验

原花青素是不同数量的黄烷-3-醇或黄烷-3，4-二醇聚合而成的聚合物的总称[1]，是目前国际上公认的清除人体自由基最有效的天然抗氧化剂，具有较强的消除自由基能力和改善人体微环境的多重功能。因其具有良好的抗氧化、清除自由基、抑制肿瘤、抗诱变等生物活性[2-10]，现已被广泛用于医药、保健品、食品及化妆品等领域。目前，研究较多的是从葡萄籽、山楂、玫瑰花、金荞麦、虎杖等中提取原花青素，本研究发现莲子壳中亦含有原花青素，首次以莲子壳作为原料，从中提取原花青素，并采用单因素试验及正交试验法优化原花青素的提取工艺。莲子壳为睡莲科植物莲的干燥成熟种子的果皮，莲子壳作为莲的副产物，资源十分丰富，但在加工过程中，多数莲子壳被丢弃，资源未被充分利用，故从莲子壳中提取原花青素属于废物再利用，具有较大的应用价值和广阔的应用前景。

1材料与方法

1.1材料与仪器

莲子壳：广昌县白莲科学研究所；葡萄籽提取物：陕西太极华青科技有限公司，纯度>95 %。

Agilent 1200高效液相色谱仪（DAD检测器）；电子天平：北京赛多利斯电子仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；KQ2200超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；甲醇、乙腈、异丙醇为色谱纯，水为三蒸水，其余试剂为分析纯。

1.2试验方法

1.2.1莲子壳原花青素最佳提取条件的确定

选取不同的乙醇体积分数（30 %～70 %）、料液比1∶4（g/mL）～1∶12（g/mL）、提取温度40℃～80℃和提取时间0.5 h～4 h，以原花青素的提取率为考察指标，进行单因素试验和正交试验，优化最佳提取条件。

1.2.2原花青素的测定方法

1.2.2.1测定原理

莲子壳中的原花青素能在热酸性条件下可醇解产生花色素，利用花色素的还原性在铁盐的催化反应下产生特征性的红色，并且在可见光区有一特征吸收峰，最大吸收峰波长为525 nm，其显色灵敏而稳定。

1.2.2.2色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18柱（4.6mm×250mm，5μm），检测器为DAD检测器，采用甲醇-水-甲酸-异丙醇（13∶73∶8∶6）为流动相；流速为1 mL/min；柱温35℃；检测波长为525 nm；进样量10 μL。见图1。

图1原花青素对照品（A）、莲子壳提取物样品（B）Fig.1 Proanthocyanidins reference substance（A），Lotus seed shell extractions（B）

1.2.2.3试验测定

将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比混合后，取出15 mL置于具塞锥形瓶中，再加入0.5 mL硫酸铁铵溶液（2 %硫酸铁铵溶液：称取硫酸铁铵2 g，用浓度为2 mol/L的盐酸溶解，定容至100 mL）和2 mL试样溶液，混匀，置沸水浴中回流，精确加热40 min后，立即置冰水中冷却，经0.45 μm滤膜过滤，待进高效液相色谱分析。

1.2.2.4溶液制备

供试品溶液的制备：将莲子壳提取液定容至适当体积，精密量取1 mL置于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，按1.2.2.3项下试样测定方法进行试验，即得供试品溶液。

对照品溶液的制备：称取原花青素对照品约15 mg，精密称定，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，即得对照品储备液。从中精密量取1.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，按1.3.2.3项下试验测定方法进行试验，即得对照品溶液。

1.2.2.5线性关系考察

分别精密量取原花青素对照品储备液0.25、0.5、1 .0、1.5、2.0 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，按1.3.2.3项下试样测定方法进行试验，再按上述色谱条件进样分析。得标准曲线方程为y = 1.547 4x-17.02 3，R2=0.999 5，x为浓度，y为峰面积。在浓度37.6 μg/mL～300.8 μg/mL范围内，线性关系良好。

2结果与讨论

2.1提取的单因素试验

2.1.1乙醇体积分数对提取率的影响

原花青素易溶于水，也易溶于甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃等有机溶剂，考虑到原花青素作为保健品食用，因此试验选取乙醇溶液作为提取剂，结果见图1。

图1乙醇体积分数对提取率的影响Fig.1 Effects of alcohol concentration on the extraction yield of proanthocyanidins

由图1可以看到，在料液比1∶10（g/mL），提取温度65℃，提取时间3 h的条件下，随乙醇体积分数的增大，原花青素提取率有先上升后下降的趋势，乙醇体积分数为50 %时，原花青素提取率最大。继续增大乙醇的体积分数，原花青素提取率开始下降。综合考虑，选择50 %、60 %、70 %作为正交试验的3个水平。

2.1.2提取温度对提取率的影响

在提取溶剂为50 %乙醇，料液比为1∶10（g/mL），提取时间为3 h条件下，不同提取温度对原花青素提取率的影响结果见图2。

图2提取温度对提取率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on the extraction yield of proanthocyanidins

由图2可知，随提取温度的升高，莲子壳原花青素提取率先上升后下降，当提取温度小于65℃时，原花青素提取率随温度的上升而提高，温度高于65℃后，原花青素提取率随温度的上升而降低，这是由于温度高于65℃时，原花青素的结构被破坏。综合考虑，选择55、65、75℃作为正交试验的3个水平。

2.1.3料液比对提取率的影响

在提取溶剂为50 %乙醇，提取温度为65℃，提取时间为3 h条件下，不同料液比对原花青素提取率的影响结果见图3。

图3料液比对提取率的影响Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on the extraction yield of proanthocyanidins

由图3可知，随着溶剂倍数的增大，莲子壳原花青素提取率逐渐增大，料液比增加到1∶10（g/mL）时，原花青素提取率的变化趋势逐渐变缓。综合考虑，选择1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）作为正交试验的3个水平。

2.1.4提取时间对提取率的影响

在提取溶剂为50 %乙醇，料液比为1∶10（g/mL），提取温度为65℃条件下，不同提取时间对原花青素提取率的影响结果见图4。

图4提取时间对提取率的影响Fig.4 Effects of time on the extraction yield of proanthocyanidins

由图4可知，提取时间小于2 h时，随着提取时间的延长，莲子壳原花青素提取率逐渐增大，提取时间延长至2 h时，原花青素提取率的变化趋势逐渐变缓。综合考虑，选择1、2、3 h作为正交试验的3个水平。

2.2正交试验结果

在单因素试验的基础上，选取乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间4个因素进行了正交试验，因素与水平、结果与分析分别如表1、表2。

由正交试验结果看出，对莲子壳中原花青素提取率的影响因素的主次顺序为：提取温度（C）>乙醇体积分数（A）>料液比（B）>提取时间（D），提取工艺的最佳组合为：C2A1B3D3，即最佳提取条件为：提取温度65℃，乙醇体积分数50 %，料液比1∶10（g/mL），提取时间3 h。进行了3次验证试验，原花青素的提取率分别为89.63 %、89.36 %、90.18 %，平均值为89.72 %，RSD为0.47 %。与正交试验2号所得提取率91.91 %相比，由最佳提取条件所得的提取率偏低，原因可能是正交试验过程中存在偶然误差，使得2号测定结果偏高，综合分析，可以将C2A1B3D3确定为最佳提取工艺。

表1正交试验L9（34）因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2正交试验结果Table 2 Results and analysis of orthogonal test

2.3莲子壳原花青素含量测定

按照上述所得莲子壳原花青素最佳提取工艺，称取莲子壳药材适量，粉碎，加入8倍药材量的50 %的乙醇溶液，65℃回流浸渍提取两次，每次3 h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至浸膏状，真空干燥后，采用上述色谱条件测定5批莲子壳提取物中原花青素的含量。测得原花青素的含量分别为38.62、38.65、38.88、37.95、38.39 g/100 g，平均含量为38.50 g/100 g，RSD为0.91 %。

3　结论

本研究采用回流浸渍法进行莲子壳原花青素的提取，以原花青素的提取率为指标，采用单因素试验与正交试验方法，考察了乙醇体积分数、提取温度、料液比及提取时间对原花青素提取率的影响。最终确定莲子壳中原花青素的最佳提取工艺如下：提取溶剂为50 %乙醇，提取温度65℃，料液比1∶10（g/mL），提取时间3 h，回流浸渍提取2次。将所得提取液减压浓缩至浸膏状，真空干燥后，可得莲子壳提取物。优选的最佳提取方法操作简单，提取物中有效成分含量稳定，适合于工业生产，为莲子壳的综合开发利用提供一定的参考价值。

参考文献：

[1]蒋其忠.茶籽壳原花青素的分离纯化、稳定性及抗氧化活性研究[D].合肥:安徽农业大学,2010

[2]王金晶,单岩,刘春凤,等.酒花原花青素抗氧化性能研究[J].食品工业科技,2013,34(8)：118-126

[3]邓雪婷,邓蕾,张明亁,等.原花青素对神经病理性疼痛模型大鼠的镇痛作用研究[J].中国现代药物应用,2013,7(13)：215-217

[4]陈菲,柳盛青,麻佳蕾.松针中原花青素闪式提取及其抗氧化活性[J].中国医药工业杂质,2014,45(2)：120-123

[5] HU Hong,QIN Yi-min.Grape seed proanthocyanidin extract induced mitochondria -associated apoptosis in human acute myeloid leukaemia14.3D10 cells[J]. Chinese Medical Journal,2006,119(5)：417-421

[6] ZHANG Xuan,HU Yi -zhen. Inhibitory Effects of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Selenite-induced Cataract Formation and Possible Mechanism[J]. Huazhong UnivSci Technol [Med Sci], 2012,32(4)：613-619

[7]钟越,齐玲,沈楠,等.越桔原花青素调控脑胶质瘤细胞生长的机制研究[J].中国病理生理杂志,2010,30(4)：603-608

[8] WANG Hui,ZHANG Chan-juan,LU Dan,et al.Oligomeric proanthocyanidin protects retinal ganglion cells against oxidative stress -inducedapoptosis[J].Neural Regeneration Research,2013,8(25)：2317-2326

[9] LU Wei-da,QIU Jie,ZHAO Gai-xia,et al.Quantitative Mitochondrial Proteomics Study on Protective Mechanism of Grape Seed Proanthocyanidin Extracts Against Ischemia/Reperfusion Heart Injury in Rat[J]. Chem Res Chinese Universities,2012,28(6):1035-1040

[10] LI Feng,XIE Hai,GAO Ying,et al. Dose-dependent effects of procyanidin on nerve growth factor expression following cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Neural Regen Res, 2008, 3(4)：390-393

Study on the Extraction Technology of Proanthocyanidins from Lotus Seed Shell by Orthogonal Test

TONG Xi-di，PENG Hong*
（Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，Jiangxi，China）

Abstract：The extraction process for proanthocyanidins in Lotus seed shell were optimized in this paper. With the content of proanthocyanidins as indexes，the single factor and orthogonal test was adopted to research the effects of 4 facters，including the concentration and volume of alcohol，solid-liquid ratio，the temperature and extraction time on the extraction yield of proanthocyanidins from Lotus seed shell. The results showed that the best extraction conditions were：extraction agent 50 % of alcohol，solid-liquid ratio 1∶10（g/mL），temperature 65℃and extraction time 3 h. The extraction process was simple and reasonable，suitable for industrial production.

Key words：Lotus seed shell；proanthocyanidins；extraction technology；orthogonal test

收稿日期：2014-07-25

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.016

*通信作者：彭红（1964—），女（汉），教授，硕士研究生导师，从事药物质量控制研究。

作者简介：童锡迪（1988—），女（汉），在读硕士研究生，从事药物质量控制研究。