江苏地区汉族人群血小板CD36抗原缺失型表型的分析

陈青，段志敏，蔡莉，陈蓉，肖建宇，黄成垠，庄云龙



江苏地区汉族人群血小板CD36抗原缺失型表型的分析

陈青，段志敏，蔡莉，陈蓉，肖建宇，黄成垠，庄云龙

【摘要】

目的探索江苏地区汉族人群血小板表面 CD36 抗原缺失型表型的多态性。

方法应用流式细胞技术检测江苏地区 140 位献血者血小板表面 CD36 抗原的表达，以及对血小板表面 CD36 抗原缺失的标本，进一步检测其单核细胞表面 CD36 的表达。结果140 名献血者中，血小板表面 CD36 抗原表达缺失的有 4 例，缺失型频率为 2.86%，其中 I 型缺失占 0.71% （1/140），II 型缺失占 2.14%（3/140）。

结论江苏地区汉族人群中，CD36 抗原表型具有多态性，血小板表面 CD36 抗原缺失型个体的频率略低于亚洲其他国家人群；其中 CD36 抗原 II 型缺失比例高于 I 型缺失。【关键词】 抗原，CD36；血小板输注；流式细胞术

www.cmbp.net.cn中国医药生物技术, 2016, 11(1):38-41

作者单位：210042 南京，江苏省血液中心（陈青、蔡莉、陈蓉、肖建宇、黄成垠）；210042 南京，中国医学科学院北京协和医学院皮肤病研究所（段志敏）；250014 济南，山东省血液中心（庄云龙）

血小板输注治疗是现代输血医学的重要内容之一。CD36 又称血小板膜糖蛋白 IV（GP1V）、Naka、GPIIIb 等，是一种表达于血小板和单核细胞等细胞表面的单链糖蛋白，在血小板聚集、抗血管生成、肿瘤免疫等方面有重要作用[1]。研究发现，个体血小板表面 CD36 抗原缺乏可受免疫刺激产生抗-CD36，已证实抗-CD36 是血小板输注无效的原因之一[2-3]，因而对献血者 CD36 抗原表达检测日益受到重视。CD36 抗原缺失的频率在世界不同地区、种族和人群中有所不同。据报道，撒哈拉的非洲人、日本人、非洲裔美国人和白种人人群 CD36抗原缺失型频率分别为 8%、3% ～ 11%、2.4% 和0.3%[1, 4-7]；国内广州汉族人群 CD36 抗原缺失型频率为 2.81%[8]；而广西地区汉族、壮族、瑶族人群 CD36 抗原缺失型频率分别为 3.59%、5.76% 和 2.38%[9-10]，提示 CD36 抗原缺失型频率不仅存在人种区别，还存在地域和民族的差异。本研究应用流式细胞术对江苏地区汉族人群献血者血小板表面的 CD36 抗原表达进行检测，并对 CD36 抗原缺失型献血者进一步分析其单核细胞 CD36 表达情况。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源随机抽取 2015 年 3 月来江苏省血液中心无偿捐献血小板的献血者 140 人，其中男 131 例，女 9 例，年龄 19 ～ 51 岁之间，平均年龄 34.25 岁，符合国家献血者健康检查标准。抽取全血 5 ml/（人）份，与 5% EDTA 抗凝剂混匀，4 ℃ 保存备用。留取单采血小板 3 ml，22 ℃ 振荡保存。

1.1.2仪器和试剂BD FACSVerseTM流式细胞仪购自美国 BD 公司；淋巴细胞分离液购自挪威Axis-Shield 公司；别藻蓝蛋白（APC）标记的抗人CD36 单克隆抗体、同型对照 APC 标记抗小鼠IgG1 抗体、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人CD14 单克隆抗体、FITC 标记的抗小鼠 IgG1 抗体均购自德国 Miltenyi 公司。

1.2方法

1.2.1标本处理将单采富血小板血浆转入另一试管，1200 × g 离心 5 min。弃去上层血浆，用 PBS洗涤血小板 2 次，然后把血小板悬浮在 PBS 中，调整血小板浓度为 106个/ml。

1.2.2外周血单个核细胞分离取外周血标本5 ml，用 PBS 以 1:1 比例稀释，应用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞。取 5 ml 淋巴细胞分离液加入 15 ml 的离心管中，缓缓加入 5 ml 的稀释的外周血，室温条件下，2200 × g 离心 22 min，小心吸取分界面的白膜层细胞，用 PBS 洗涤 2 次，然后悬浮在 PBS 中，调整细胞浓度为 106个/ml。1.2.3血小板 CD36 表型的筛查取 100 μl 血小板悬液加入 10 μl APC 标记的抗人 CD36 单克隆抗体，APC 标记抗小鼠 IgG1 抗体作为同型对照，混匀，4 ℃ 避光孵育 10 min。1800 × g 离心5 min，洗涤 3 次，振荡混匀，悬浮在 200 μl PBS中，流式细胞仪检测，通过 FSC/SSC 设血小板门，以 Flow Jo 7.6.2. 软件分析血小板表面的平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）。

1.2.4血小板 CD36 缺失型的表型分型血小板CD36 抗原缺失型样本的 PBMCs 同时用 APC标记的抗人 CD36 单克隆抗体和 FITC 标记的抗人 CD14 单克隆抗体进行标记，取 100 μl 单个核细胞分别加入 10 μl APC 标记的抗人 CD36 单克隆抗体及 10 μl FITC 标记的抗人 CD14 单克隆抗体，在对照管中加入相应的同型对照抗体，混匀，4 ℃ 避光孵育 10 min，260 × g 离心 5 min，以PBS 洗涤 3 次，振荡混匀，悬浮在 200 μl PBS 中，进行流式细胞仪检测，通过 FSC/SSC 设单核细胞门，用 Flow Jo 7.6.2. 软件分析。

1.3统计学处理

采用 Flow Jo 7.6.2. 分析软件中的平均荧光强度（MFI）计算血小板和单核细胞表面 CD36 抗原的表达量，数据以x±s表示，用 t 检验进行统计分析，P < 0.05 具有统计学意义。

2　结果

2.1血小板表面 CD36 抗原表达的检测

140 位无偿献血者中，共筛选出 4 名血小板表面 CD36 抗原缺失的个体（表1），代表性标本的流式细胞图如图1A 所示，CD36 抗原缺失型频率为 2.86%（4/140）。

2.2单核细胞上 CD36 抗原的表达与 CD36 抗原缺失型的表型分析

对筛选出的 4 位血小板表面 CD36 抗原缺失型个体，用流式细胞仪检测其单核细胞上 CD36 的表达，发现 1 人为 I 型 CD36 抗原缺失，3 人为II 型 CD36 抗原缺失（表2），所占比例分别为0.71% 和 2.14%。代表性标本的流式细胞图见图1B。

表1　血小板表面 CD36 抗原的表达检测Table 1　Analysis of CD36 antigen expression on PLTs

图1　典型检测血小板（A）和单核细胞 CD36 抗原表达（B）的流式图（a：正常个体同型对照；b：正常个体；c：I 型 CD36缺失个体；d：II 型 CD36 缺失个体；x 轴表示 APC的 MFI，y 轴在 A 中表示血小板计数，y 轴在 B 中表示单核细胞中 FITC 的 MFI）Figure 1　Representative pictures of flow cytometry analysis of CD36 expression on PLTs (A) and monocytes (B), respectively (a: Isotype control; b: Normal control; c: Type I CD36 deficiency; d: Type II CD36 deficiency; x axis showed the MFI of APC, and y coordinate showed counts of PLTs in A and showed the monocytes MFI of FITC in B)

表2　单核细胞 CD36 抗原的表达检测Table 2　Analysis of CD36 antigen expression on monocytes

3　讨论

CD36 抗原缺失分为两型，I 型缺失是指在血小板和单核细胞上均不表达 CD36，而 II 型缺失是指仅在血小板上不表达 CD36。CD36 抗原缺失分布存在人种上的差异，本实验结果显示，江苏地区献血人群中的 CD36 缺失频率和国内报道的广州地区及南宁地区的相似[8-9]，略低于日本人，但远高于白种人[7]。但值得注意的是：广州地区汉族人群 CD36 抗原缺失均为 II 型缺失（2.81%），没有发现 I 型缺失[8]；广西地区汉族人群中发现 II 型缺失型频率约为 2.18%，I 型缺失型频率约为1.41%[10]；深圳地区汉族人群中发现 II 型缺失型频率约为 2.75%，I 型缺失型频率约为 0.31%[11]；而本实验发现 II 型缺失型频率约为 2.14%，I 型缺失型频率为 0.71%。这些数据表明汉族人群 CD36抗原 II 型缺失型频率可能分布在 1.50% ～ 2.81%，I 型缺失型频率可能分布在 0 ～ 1.41%。Yamamoto 等[12]报道 CD36 抗原缺失 II 型在日本人群中约占 4.0%，I 型约占 0.56%，提示日本人群 CD36 缺失频率高于中国人群，主要体现在 II 型缺失上。

CD36 抗原缺失的患者可产生抗 CD36 的同种抗体，从而造成血小板输注无效、新生儿免疫性血小板减少症等疾病，输血后紫癜以及妊娠妇女流产和死胎的现象[2, 13]。Saw 等[2]报道 2 例 CD36抗原缺失的白血病患者输注 HLA 配型相合的单采血小板后均发生输注无效，实验室检测结果表明该患者为 CD36 缺失型，并且 CD36 抗体检测为阳性。随后在为该患者输注 CD36 抗原阴性的献血员单采血小板后，CCI 指数明显上升。Ohto 等[13]报道了 CD36 抗原缺失的妊娠妇女产生 CD36 抗体从而引起胎儿/新生儿溶血病或死胎流产现象。

目前，血小板输注无效已成为国内外临床极棘手的问题，血小板输注无效患者中 CD36 抗原缺失的频率在国内偶有报道[3]，还没有引起足够的重视。但有证据表明血小板和（或）单核细胞上 CD36 抗原的缺失所产生的抗 CD36 的同种抗体与基因突变有关。下一步我们将继续扩大筛查规模，积累更多的 CD36 缺失型供者，并深入研究 CD36 基因突变与抗原缺失的关系，这将有助于对血小板输注无效及其他临床疾病患者做个性化的治疗，对提高输血安全有重要的临床意义。

参考文献

[1] Curtis BR, Ali S, Glazier AM, et al. Isoimmunization against CD36 (glycoprotein IV): description of four cases of neonatal isoimmune thrombocytopenia and brief review of the literature. Transfusion, 2002, 42(9):1173-1179.

[2] Saw CL, Szykoluk H, Curtis BR, et al. Two cases of platelet transfusion refractoriness associated with anti-CD36. Transfusion, 2010, 50(12):2638-2642.

[3] Wu GG, Zhou Y, Zhong ZL, et al. Experimental study on the platelet transfusion refractoriness mediated by the anti-CD36; four cases reports in China. Chin J Blood Transfus, 2014, 27(1):18-21. (in Chinese)

吴国光, 周燕, 钟周琳, 等. 抗-CD36介导血小板输注无效的实验研究——附4例病例报告. 中国输血杂志, 2014, 27(1):18-21.

[4] Lee K, Godeau B, Fromont P, et al. CD36 deficiency is frequent and can cause platelet immunization in Africans. Transfusion, 1999, 39(8):873-879.

[5] Bierling P, Godeau B, Fromont P, et al. Posttransfusion purpura-like syndrome associated with CD36 (Naka) isoimmunization. Transfusion, 1995, 35(9):777-782.

[6] Fry AE, Ghansa A, Small KS, et al. Positive selection of a CD36 nonsense variant in sub-Saharan Africa, but no association with severe malaria phenotypes. Hum Mol Genet, 2009, 18(14):2683-2692.

[7] Curtis BR, Aster RH. Incidence of the Nak(a)-negative platelet phenotype in African Americans is similar to that of Asians. Transfusion, 1996, 36(4):331-334.

[8] Wang JL, Ye X, Luo GP, et al. The platelet CD36 expression screening in donors in Guangzhou district. Guangzhou Medl J, 2011, 42(4):45-47. (in Chinese)

王嘉励, 叶欣, 罗广平, 等. 广州地区无偿献血者中血小板CD36表达的筛查. 广州医药, 2011, 42(4):45-47.

[9] Wu GG. The progress of platelet immune biology and international academic cooperation. Chin J Blood Transfus, 2010, 23(10):855-857. (in Chinese)

吴国光. 血小板免疫生物学的进展和国际学术合作. 中国输血杂志, 2010, 23(10):855-857.

[10] Zhong ZL, Shen WD, Zhou Y, et al. Characteristic and structure analysis of CD36 deficiency in Han, Zhuang and Yao population from Guangxi region in China. Chin J Blood Transfus, 2014, 27(1):14-17. (in Chinese)钟周琳, 申卫东, 周燕, 等. 广西地区汉、壮和瑶族人群CD36缺失结构实验分析和特征研究. 中国输血杂志, 2014, 27(1):14-17.

[11] Li DC, Lan YX, Bao ZQ, et al. The phenotype of platelet CD36 deficiency in the blood donors of Shenzhen, China. Chin J Blood Transfus, 2012, 25(4):304-307. (in Chinese)

李大成, 蓝欲晓, 鲍自谦, 等. 深圳地区无偿献血者群体CD36 抗原缺失型的表型分析. 中国输血杂志, 2012, 25(4):304-307.

[12] Yamamoto N, Akamatsu N, Sakuraba H, et al. Platelet glycoprotein IV (CD36) deficiency is associated with the absence (type I) or the presence (type II) of glycoprotein IV on monocytes. Blood, 1994, 83(2):392-397.

Author Affiliation: Jiangsu Province Blood Center, Nanjing 210042, China (CHEN Qing, CAI Li, CHEN Rong, XIAO Jian-yu, HUANG Cheng-yin); Institute of Dermatology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Nanjing 210042, China (DUAN Zhi-min); Blood Center of Shandong Province, Jinan 250014, China (ZHUANG Yun-long)

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(1):38-41

·协会之窗·

[13] Ohto H, Miura S, Ariga H, et al. The natural history of maternal immunization against foetal platelet alloantigens. Transfus Med, 2004, 14(6):399-408.

Analysis of CD36 antigen deficiency phenotypes on the platelets in Jiangsu Han population

CHEN Qing, DUAN Zhi-min, CAI Li, CHEN Rong, XIAO Jian-yu, HUANG Cheng-yin, ZHUANG Yun-long

【Abstract】

ObjectiveTo explore the polymorphisms of CD36 antigen deficiency on the platelets (PLTs) surface of the Han population in Jiangsu region.

MethodsFlow cytometry was used to detect the CD36 antigen expression on PLTs in 140 blood donors in Jiangsu region. Donors without CD36 antigen expression on their PLTs surface were further to be determined the expression of CD36 antigen on their peripheral blood monocyte cells.

ResultsOf the 140 healthy blood donors analyzed, 4 individuals failed to express CD36 antigen on PLTs and the rate of CD36 deficiency was 2.86%; One of them without CD36 on PLTS expressed no CD36 antigen on his PBMCs either. The rates of Type I and Type II CD36 deficiency among the study population were 0.71% (1/140) and 2.14% (3/140), respectively.

ConclusionThe CD36 antigen phenotype is polymorphic in the Jiangsu Han population, and the rate of the Type II CD36 deficiency was higher than that in Type I. The study findings indicated that the frequency of CD36 deficiency in the Chinese population is slightly lower than that in other Asian countries.

【Key words】Antigen, CD36;Platelet transfusion;Flow cytometry

Corresponding Author:ZHUANG Yun-long, Email: yunlongzhuang@gmail.com

收稿日期：2015-09-28

通信作者：庄云龙，Email：yunlongzhuang@gmail.com

基金项目：江苏省重点研发计划（社会发展）项目（BE2015717）；江苏省“十二五”期间“科教兴卫工程”医学重点人才项目（RC2011088）；江苏省第十批“六大人才高峰”项目（2013-WSW-039）；江苏省第四期“333 高层次人才培养工程”；2010，2014 年度江苏省卫生国际交流支撑计划项目；山东省医药卫生科技发展计划重点项目（2013WS0170）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.008