新型葡萄球菌肠毒素多重PCR检测方法的建立

王慧煜,梅　琳,王　晶,李　琳,黄金海*,韩雪清*

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100029；2.天津大学生命科学学院,天津 300072)



新型葡萄球菌肠毒素多重PCR检测方法的建立

王慧煜1,梅琳1,王晶1,李琳2,黄金海2*,韩雪清1*

(1.中国检验检疫科学研究院,北京 100029；2.天津大学生命科学学院,天津 300072)

摘要:针对新发现的SEO、SEQ、SER、SEU等4个葡萄球菌肠毒素基因型，分析比对GenBank中报道的序列，设计特异性引物，进一步通过调节退火温度、模板浓度和多重PCR引物浓度等，优化了多重PCR反应体系，建立了同时检测4种金黄色葡萄球菌肠毒素的多重PCR检测方法。该方法可同时扩增出4种新的肠毒素基因，与其他基因型无交叉反应，对SEO、SEQ、SER、SEU检测的敏感性分别达到1.45×102、2.34×103、1.89×102、2.09×102pg。可对新型葡萄球菌肠毒素进行快速、准确的检测与分型。

关键词:葡萄球菌；肠毒素；多重PCR；检测

葡萄球菌(Staphylococcus)是引起食物中毒最普遍的细菌之一，是动物性食品的重要致病菌，广泛分布于自然界，如空气、土壤、水及其他环境。因此，食品受其污染的机会很多。引起葡萄球菌食物中毒的主要物质是其产生的一种外毒素，葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)。葡萄球菌肠毒素食物中毒是个世界性卫生问题，美国、加拿大等国家，葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占所有食物中毒事件病原的50%，是最常见的食物中毒类型。我国每年发生的此类中毒事件也非常多，全国各地均有报道。

自从1959年葡萄球菌肠毒素被证实以来，除了最早被人们发现和熟知的5种肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE和毒性休克综合症毒素1(toxic shock syndrome toxin-1，TSST-1)外，近几年又发现了SEG、SHE、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SET、SEU等新的肠毒素[1-3]。相关研究已证明，新发现的葡萄球菌肠毒素基因出现的频率很高，Becker K等[4]研究表明，如果葡萄球菌肠毒素的检测扩展到新发现的肠毒素基因，葡萄球菌的检出率会提高22.2%。因此，新发现的肠毒素引起的食物中毒应引起足够的重视。目前已报道的葡萄球菌肠毒素已达20余种，但国内外研究报道的检测技术局限于传统葡萄球菌肠毒素基因，尚缺乏对不同毒素型尤其是新型毒素系统分型的检测技术，容易出现葡萄球菌的漏检问题，为口岸进出境动物产品中葡萄球菌的检测带来困难。

本研究拟利用多重PCR技术的高效扩增性，建立同时检测4种新型葡萄球菌肠毒素基因的PCR方法，以便对葡萄球菌肠毒素进行快速、准确的检测与分型。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株葡萄球菌产肠毒素SEO、SEQ、SER、SEU的菌株和产其他肠毒素的菌株由天津大学化工学院提供；肠炎沙门菌、痢疾志贺菌、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、肠毒素型大肠埃希菌购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2试剂DNA提取试剂盒(TIAamp Bacteria DNA Kit)为北京天根有限公司产品；E.Z.N.A.Gel Extraction Kit和Plasmid Mini Kit为OMEGA有限公司产品；E.coliCompetent Cells JM109、DNA Maker DL 2 000、dNTP Mixture和TaKaRaTaqTM为宝生物(大连)有限公司产品；PGEM-T Easy Vector Systems为Promega公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计参照GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中公开发表的SEO、SEQ、SER、SEU核酸序列，通过Bioedit软件进行比对，应用Prmer5.0和OMIGA软件设计4对引物[3]。参照文献[5]的方法合成葡萄球菌肠毒素通用的16 S rDNA引物。

1.2.2模板DNA的提取参照TIAamp Bacteria DNA Kit说明书提取葡萄球菌产SEO、SEQ、SER、SEU菌株和其他待检菌株DNA。

1.2.3检测葡萄球菌肠毒素的多重PCR反应 的建立根据引物的Tm值设定了多个退火温度，包括47、49、51、53 ℃和55 ℃，分别在不同退火温度下同时扩增各目标片段。上、下游引物分别按照1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例加入，同时扩增各目标片段。分别加入0.5、1、2、3、4、5 μL模板DNA，同时扩增各目标片段。反应结束后取5 μL产物用15 g/L~20 g/L琼脂糖凝胶电泳，120 V电泳25 min，紫外检测扩增产物，进行结果分析。

1.2.4特异性试验用上述方法对肠炎沙门菌、痢疾志贺菌、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、肠毒素型大肠埃希菌进行特异性检测试验。

1.2.5敏感性试验 将金黄色葡萄球菌在LB肉汤培养基37 ℃培养6 h后提取DNA，用紫外分光光度计检测260 nm和280 nm下的OD值，换算成DNA浓度。将DNA分别进行10倍梯度稀释后，采用优化的多重PCR体系进行检测。

1.2.6田间样品试验对采集自不同口岸的动物产品中分离到的68株葡萄球菌进行新型肠毒素基因SEO、SEQ、SER、SEU检测。

2结果

2.1单重PCR扩增结果

葡萄球菌肠毒素SEO、SEQ、SER、SEU基因扩增后获得的片段与预期大小完全一致，分别为756、222、168、442、319 bp(图1)。

M. DNA标准DL 2 000；1. 16 S rDNA；2. SEO；3. SEQ；4. SER；5. SEU；6.阴性对照

M. DNA Marker DL 2 000；1. 16 S rDNA；2. SEO；3. SEQ；4. SER；5. SEU；6. Negative control

图1各基因PCR扩增结果

Fig.1The PCR results of genes

2.2多重PCR扩增结果

分别在47、49、51 、53 、55 ℃条件下同时扩增各目标片段。结果显示，在51 ℃时扩增条带清晰，大小片段差异明显。上、下游引物分别按照1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的比例对各目标片段进行扩增，发现上、下游引物的比例为1∶1时，5个扩增条带全部清晰。分别加入0.5、1、2、3、4、5 μL模板DNA，同时扩增各目标片段，结果表明加入2 μL模板DNA时，扩增的所有条带清晰，容易分辨。通过优化多重PCR反应体系，最终形成的反应体系和程序如下：

多重PCR反应体系(25 μL)：10×buffer(含MgCl2)2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L) 2 μL，上游引物(10 pmol/μL) 1 μL，下游引物(10 pmol/μL) 1 μL，模板DNA 2 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL) 1 μL，双蒸水补齐至25 μL。

PCR反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，46 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共5个循环；94 ℃ 30 s，51 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，共30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保温。产肠毒素SEO、SEQ、SER、SEU的菌株混合后，提取DNA进行多重PCR扩增。结果如图2所示，可同时扩增出756、222、168、442 bp和319 bp特异性条带，并且差异明显、清晰易分。

M. DNA标准DL 2 000；1. 混合菌株；2. 16 S rDNA；3. SER；4. SEU；5. SEO；6. SEQ

M. DNA Marker DL 2 000；1. Mixture of bacteria；2. 16 S rDNA；3. SER；4. SEU；5. SEO；6. SEQ

图2多重PCR扩增结果

Fig.2The multiplex PCR results of SEO，SEQ，SER，SEU genes

2.3特异性试验

用上述方法对肠炎沙门菌、痢疾志贺菌、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、肠毒素型大肠埃希菌进行特异性检测试验。肠炎沙门菌、痢疾志贺菌、副溶血性弧菌、奇异变形杆菌、肠毒素型大肠埃希菌的检测结果均为阴性，未扩增出任何条带。而混合菌株可以同时扩增出5个条带，说明该多重PCR能特异性地扩增出产肠毒素SEO、SEQ、SER、SEU基因的特异性片段(图3)，而不能扩增出其他常见细菌。

2.4敏感性试验

产肠毒素SEO、SEQ、SER、SEU的金黄色葡萄球菌在LB肉汤培养基37 ℃培养6 h后提取的DNA浓度分别为1.45×106、2.34×106、1.89×106、2.09×106pg。分别经10倍倍比稀释后进行多重PCR，结果如图4所示，所建立的多重PCR对SEO、SEQ、SER、SEU检测的敏感性分别达到1.45×102、2.34×103、1.89×102、2.09×102pg。

M. DNA标准DL 2 000；1.混合菌株；2.肠炎沙门菌；3.痢疾志贺菌；4.副溶血性弧菌；5.奇异变形杆菌；6.肠毒素型大肠埃希菌；7.阴性对照

M. DNA Marker DL 2 000；1. Mixture of bacteria；2.Salmonellaenteritidis；3.Shigelladysenteriae； 4.Vibrioparahemolyticus；5.Proteusmirabilis；6. EnterotoxigenicE.coli；7. Negative control

图3多重PCR特异性试验

Fig.3Specificity test of the multiplex PCR

M. DNA标准DL 2 000；1.阳性对照；2. 107pg；3. 106pg；4. 105pg；5. 104pg；6. 103pg；7. 102pg；8. 10 pg；9. 1 pg；10. 阴性对照

M. DNA Marker DL 2 000；1. Positive control；2. 107pg；3. 106pg；4. 105pg；5. 104pg；6. 103pg；7. 102pg；8. 10 pg；9. 1 pg；10. Negative control

图4多重PCR敏感性试验

Fig.4Sensitivity test results of the multiplex PCR

2.5田间样品试验

对采集自不同口岸的动物产品中分离到的68株葡萄球菌，提取DNA后，采用本研究建立的多种PCR检测方法，进行新型肠毒素基因SEO、SEQ、SER、SEU的检测。从图5统计结果看，在分离的68株葡萄球菌中，SEQ检出率最高，约占全部菌株的22.6%，其次分别是SEO(15.2%)、SEU(11.9%)和SER(8.1%)。

图5　各型肠毒素基因检出率

3讨论

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起食物中毒的一种重要细菌，能够在很宽广的温度范围(7 ℃~48.5 ℃)，pH(4.2~9.3)，高盐(NaCl浓度高达150 g/L)的环境中存活，这些特性使葡萄球菌很容易通过各种途径和方式，在动物产品、食品和饲料等制备和加工过程中造成污染。酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前应用最为广泛的检测肠毒素的方法，广泛应用于各型肠毒素的检测。然而，ELISA检测肠毒素时，葡萄球菌A蛋白、内源性酶类、基质蛋白可以导致假阳性反应的发生。分子生物学方法在肠毒素基因检测、研究肠毒素基因的表达情况和各型之间的关系，深入认识其毒素性质方面的重要作用日益凸显[6]，国内外均有有采用PCR方法检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因的报道[2-3, 7-9]。但目前报道的肠毒素基因PCR检测方法，大多是针对单一基因的方法，由于葡萄球菌分布的广泛性及新型肠毒素基因不断产生及其多样性，使研究针对多种葡萄球菌肠毒素基因的多重检测方法的需求变得尤为突出。本研究通过对GenBank中报道的新型肠毒素基因SEO、SEQ、SER、SEU的序列进行分析比对，设计了不同型基因检测的特异性引物，并进一步通过调节退火温度、模板浓度和多重PCR引物浓度等措施，优化了多重PCR反应体系，建立了同时检测4种金黄色葡萄球菌肠毒素的多重PCR检测方法。PCR技术作为一种灵敏、快速简便而且经济实用的检测方法已经在许多领域得到广泛应用，尤其是多重PCR技术倍受青睐，当样品数量大、检测目标多时，多重PCR显示出独特的优势，能够高通量、低成本的进行批量快速检测多个目标。

以前对葡萄球菌肠毒素的研究多集中在SEA-SEE等常见毒素功能及检测方法的研究[2, 10-11]，对新近发现的肠毒素功能的研究不多[12]。目前，SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO等基因已被克隆或发现[13-15]。最近又不断有更新的SE样肠毒素发现，对新发现的基因分布研究刚刚起步。国外最新的相关研究已证明新发现的金黄色葡萄球菌肠毒素基因出现的频率很高[2]。本研究是针对新发现的SEO、SEQ、SER、SEU等4个基因建立的多重PCR检测方法，可同时扩增出4种新的肠毒素基因，与其他基因型无交叉反应，并且对SEO、SEQ、SER、SEU检测的敏感性分别达到1.45×102、2.34×103、1.89×102、2.09×102pg。此4个不同基因型的敏感度不完全一致也有待提高，可能与多对引物之间的相互影响有关，这也是下一步要进行的研究工作之一。

用本研究建立的多重PCR方法，对田间分离的68份样品进行检测，发现各种基因型均有检出，其中SEQ检出率最高，约占全部菌株的22.6%，其次分别是SEO(15.2%)、SEU(11.9%)和SER(8.1%)。检测结果进一步证明了所建立方法的可靠性与稳定性，为葡萄球菌病防控提供有效的早期快速诊断方法奠定了基础，因此在维护公共卫生安全方面具有十分重要的意义。

参考文献：

[1]Letertre C, Perelle S, Dilassep F, et al. Identification of a new putative enterotoxin SEU encoded by the egc cluster ofStaphylococcusaureus[J]. J App Microbiol,2003,95(1) :38-431.

[2]傅丹青，陈棋炯，丁水军，等. 金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测与分型[J]. 中国卫生检验杂志,2011,21(5)：1167-1169.

[3]谢秀兰，刘溪源，王建东，等.乳源金黄色葡萄球菌9种肠毒素基因的检测[J]. 动物医学进展,2014,35(7):25-28.

[4]Becker K, Friedrich A W, Lubritz G, et al. Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantigens and exfoliative toxins among strains ofStaphylococcusaureusisolated from blood and nasal specimens[J]. J Clin Microbiol,2003,41(4):1434-1439.

[5]Zhang K, Sparling J, Chow B L, et al. New quadriplex PCR assay for detection of methicillin and mupirocin resistance and simultaneous discrimination ofStaphylococcusaureusfrom coagulase-negative staphylococci[J]. J Clin Microbiol,2004,42:4947.

[6]刘飞，李永明，金伯泉. 金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法的研究进展[J]. 细胞与分子免疫学杂志,2010,26(5)：511-513.

[7]Omoe K, Ishikawa M, Shimoda Y, et al. Detection of seg, seh, and sei genes inStaphylococcusaureusisolates and determination of the enterotoxin p roductivities ofS.aureusisolates harboring seg, seh, or sei genes[J].J ClinMicrobiol,2002,40(3) :857-862.

[8]Rosec J P, Gigaud O. Staphylococcal enterotoxin genes of classical and new types detected by PCR in France[J]. Int J Food Microbiol,2002,77(1-2):61-70.

[9]王营, 于宏伟, 郭润芳，等. 金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布的研究[J]. 河北农业大学学报,2010,33(5)：84-88.

[10]刘伟，王菊光，孙晓华，等. 日常食品及食物中毒样本中金黄色葡萄球菌肠毒素的分型检测分析[J]. 中国预防医学杂志,2013,14(8):608-611.

[11]何晖，刘华章，魏泉德. PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、E基因的研究[J]. 中国卫生检验杂志,2012,22(7):1585-1588.

[12]杨静，杨军，黄继超，等. 食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布与时序性表达[J]. 中国农业科学,2012,45(19):4057-4066.

[13]王娟，黄秀梅，刘书科，等. 牛奶中金黄色葡萄球菌的耐药性及其肠毒素分型研究[J]. 中国兽医杂志,2013,49(3):30-32.

[14]徐继达，于宏伟，郭润芳，等. 对5种新型金黄色葡萄球菌肠毒素来源关系的探究[J]. 食品科技,2013,38(7):315-319.

[15]刘伟，王菊光，孙晓华，等. 日常食品及食物中毒样本中金黄色葡萄球菌肠毒素的分型检测分析[J]. 中国预防医学杂志,2013,14(8):608-611.

Establishment of Multiplex PCR for Simultaneous Detection of New Entertoxin Genotypes ofStaphylococcus

WANG Hui-yu1,MEI Lin1,WANG Jing1,LI Lin2,HUANG Jin-hai2,HAN Xue-qing1

(1.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing,100029,China;2.SchoolofLifeScience,TianjinUniversity,Tianjin,300072,China)

Abstract:Our study designed 4 pairs of primers to detect 16 S rDNA and SE genes(SEO, SEQ, SER, SEU) based on bioinformatics analyzing, optimized conditions of PCR amplification and staphylococcal genome extraction to establish a systematic approach to rapid and simultaneous detection of different genotypes of SEs by multiplex PCR method. The sensitivity and specificity of the method were evaluated with different entertoxin genotypes of Staphylococcus and other standard bacterial isolates. The results showed that the method was very specific and sensitive.The sensitivities for detecting SEO,SEQ,SER and SEU reached 1.45×102, 2.34×103, 1.89×102and 2.09×102pg.The method can detect and type novel staphylococcal enterotoxins rapidly and accurately

Key words:Staphylococcus;entertoxin genotype;multiplex PCR;detection

文章编号:1007-5038(2016)02-0019-04

中图分类号:S852.611

文献标识码:A

作者简介：王慧煜(1978-)，女，山西祁县人，高级兽医师，博士,主要从事微生物分子生物学研究。*通讯作者

基金项目：国家质检总局科技计划项目(2012IK027)；国家科技支撑计划课题(2012BAK11B04)

收稿日期：2014-11-14