淫羊藿水煎液对小鼠不同免疫水平模型的干预作用

杨晓旭，王　宇，韩贞爱，薛　迪，刘树民

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)



·实验研究·

淫羊藿水煎液对小鼠不同免疫水平模型的干预作用

杨晓旭，王宇，韩贞爱，薛迪，刘树民*

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

摘要：目的通过构建3个小鼠免疫系统模型，研究淫羊藿水煎液(WDE)对小鼠免疫系统的综合作用关系，从而为淫羊藿临床治疗免疫系统疾病提供理论依据。方法通过构建小鼠迟发型特异性超敏反应(DTH)模型、以碳粒廓清法检测的正常小鼠和非特异性免疫低下小鼠模型、刀豆蛋白(ConA)诱导的体外小鼠脾淋巴细胞增殖3种模型,考察淫羊藿对不同水平免疫模型的调节作用。结果WDE能够有效降低超敏反应下的脾系数和炎症因子IL-2、IL-4水平(P<0．01)；碳粒廓清法中，给药组与空白组相比WDE可使正常生理状态下小鼠的脾系数和廓清指数明显降低(P<0.05)，而同样给予环磷酰胺的模型给药组与模型组相比WDE可使免疫低下小鼠的脾系数、胸腺系数、廓清指数、吞噬指数均明显升高(P<0.05)；此外，WDE能显著抑制ConA诱导的脾淋巴细胞增殖反应(P<0．01)，且其作用强度呈剂量依赖性。结论WDE对DTH小鼠和正常小鼠均有免疫抑制作用，体外亦能抑制脾淋巴细胞的增殖，并且对免疫低下小鼠有显著的免疫增强和保护作用，淫羊藿水煎液可能对免疫系统有双向调节作用。

关键词：淫羊藿水煎液；免疫系统；调节作用

淫羊藿(epimedii folium)为小檗科植物，别名淫羊藿，味辛、甘，性温，始载于《神农本草经》，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿功效，是传统的补虚壮阳中药材。现代药理学研究[1-2]表明，淫羊藿具有调节机体免疫功能，增强雄性生殖功能、抗骨质疏松、抗炎抗病毒抗氧化、改善心血管系统病变和促进骨髓造血系统功能等作用。近年来，大量实验研究[3-4]表明，淫羊藿及其提取物对机体免疫功能有显著增强和调节作用，但以往研究针对的模型过于单一，综合性分析不强。本研究通过建立小鼠多个免疫功能评价模型，分析淫羊藿水煎液作用下各个模型的指标变化，从正常生理状态、超敏反应病理状态和免疫低下病理状态总结其对小鼠免疫系统作用的综合性研究，从而为中药临床治疗免疫系统疾病提供理论依据。

1材料

1．1实验动物KM小鼠由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，保持饲养环境温度22 ℃，8:00 am到8:00 pm人工灯光照明，标准小鼠饲料喂养，自由饮水。

1．2药材与试剂淫羊藿药材购自世一堂中药材有限公司，批号130916，产地黑龙江。PBS磷酸盐缓冲液(北京博奥拓达科技有限公司，140703)，刀豆蛋白(sigma:C-2010)，改良型RPMI-1640培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司，NZD1134)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司,140520)，青霉素链霉素混合液(北京博奥拓达科技有限公司，20140512)，MTT(sigma:M2128)，二甲基亚砜(天津凯通化学试剂有限公司,20140510)，2，4-二硝基氟苯(成都格雷西亚化学技术有限公司，D16877)，橄榄油(欧丽薇兰，20140331)，丙酮(天津市化学试剂六厂三分厂,20110620)，印度墨汁(北京博奥拓达科技有限公司，20130718)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司,13121825)。

1．3实验仪器AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，DL-CJ-1ND医用型治净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，MK3酶标仪(Thermo)，CO2孵育箱(Heal Force,HF90),TGL-20M高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，UVmini-1240型紫外分光光度计(日本岛津)。

2方法与结果

2．1淫羊藿水煎液对DNFB诱导的小鼠迟发型特异性超敏反应(DTH)的影响

2．1．1动物分组、造模及给药量取体质量18～22 g昆明小鼠30只，雌雄各半，随机分为空白组、模型组和给药组，每组10只，模型和给药组小鼠腹部皮肤去毛约1 cm ×2 cm区域，然后用微量移液器取1%DNFB(溶于橄榄油∶丙酮=1∶1中)50 μL，均匀滴加于脱毛区致敏，并且于致敏当天开始，给予淫羊藿水煎液208 mg/kg(按2010药典中临床生药量10 g/d计算)，给药体积为0．1 mL/10 g，空白组给同体积生理盐水，连续7 d。末次给药30 min后，用微量移液器取10 μL的1%DNFB，均匀滴加于小鼠右耳前后两面触发，造成DTH模型。

2．1．2取材与测定指标 末次给药24 h后称体质量，脱颈椎致死，称量脾脏和胸腺的重量，脾指数=脾重×10/体质量；胸腺指数=胸腺重×10/体质量。分别剪下双耳，用8 mm打孔器在相同部位打下圆耳片，电子天平称重，以左、右耳片重量差值作为肿胀度；摘眼球取血，静置2 h后低温离心制备血清，elisa法测定血清中的IL-2和IL-4的含量。

抑制率=对照组平均肿胀度—给药组平均肿胀度/对照组平均肿胀度×100%

2．1．3淫羊藿水煎液对DNFB所致DTH的影响结果见表1。

2．2淫羊藿水煎液分别对正常小鼠和免疫低下小鼠非特异性单核细胞吞噬作用及免疫器官的影响(碳粒廓清法)

2．2．1动物分组、造模与给药量取体质量18～22 g昆明小鼠40只，随机分为空白组、模型组、给药组和模型给药组，雌雄各半。给药组每天给予淫羊藿水煎液208 mg/kg，给药体积为0．1 mL/10g，连续给药10 d，空白组和模型组给同体积生理盐水。模型组和模型给药组于第7～10天，每天灌胃30 min后皮下注射环磷酰胺80 mg/kg，1次/d，注射体积为0．1 mL/10 g。

±s，n=10)

注：与空白组比较，##P<0．01，与模型组比较，△△P<0．01

2．2．2单核细胞吞噬功能的考察[5-6]末次给药后24 h，按0．1 mL/10 g尾静脉注射稀释的印度墨汁(1%明胶稀释4倍)，于注入墨汁后2、6 min分别从眼静脉丛取血20 μL，立即加入装有2 mL的0．1% Na2CO3的试管中，以0．1% Na2CO3溶液做空白对照，于600 nm下测定OD值，带入下列公式计算廓清指数和吞噬指数，并且脱臼处死后取脾脏和胸腺称重，按2．1．2中方法测脾指数和胸腺指数。

廓清指数：k=(lgOD1—lgOD2)/(T2—T1)；

吞噬指数：α=K1/3×(体质量/肝重+脾重)

2．2．3淫羊藿水煎液分别对正常小鼠和免疫低下小鼠单核细胞吞噬作用及免疫器官的影响结果见表2。

±s，n=10)

注：与空白组比较，#P<0．05，##P<0．01；与模型组比较，△P<0．05

2．3淫羊藿水煎液对ConA诱导的小鼠体外脾细胞增值的影响

2．3．1小鼠脾淋巴细胞制备将1640培养基、胎牛血清、青霉素链霉素液按90∶10∶1比例混合，制成培养基混合液。取健康昆明雄性小鼠1只，禁食禁水12 h后处死，于超净工作台中解剖，取脾脏放入平皿中用PBS清洗后，转移至100目不锈钢筛网上，用无菌注射器芯挤压研磨脾组织，并用PBS轻轻冲洗钢网，制成脾细胞悬液，分装在两只10 mL的离心管中，离心后去上清液，分别装入8 mL的PBS，用移液枪吹打冲洗管壁，再离心去上清液，重复2次后加入培养基混合液反复吹打管壁，配成6×106个/ mL的均匀细胞悬液。

2．3．2给药浓度确定及细胞毒作用考察在96孔板中，每孔加100 μL的2．4．1中的细胞悬液，设空白孔、模型孔、各浓度给药孔，药粉加培养基溶解过膜后配制成8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0．062 5 mg/mL。

2．3．3接种细胞在96孔板中，每孔加100 μL的2．3．1项下的细胞悬液，实验分为空白组、模型组、各剂量给药组，每组平行三复组，除空白组外其他各组均加入20 μL浓度为35 mg/mL的ConA，低、中、高给药组分别加入浓度为0．25、0．5、1 mg/mL的过膜后的淫羊藿水煎液各20 μL，空白组和模型组分别补充培养基混合液至等体积。将96孔板置于37 ℃的CO2孵箱，饱和湿度下培养44 h后，各孔避光加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后2 000 r/min离心，弃上清，加入DMSO溶解液150 μL，30 min后在492 nm下用酶标仪测定各孔的吸光度值，小鼠脾淋巴细胞存活率=样品孔均值/(空白孔均值×100%)。

2．3．4淫羊藿水煎液对ConA诱导的小鼠体外脾淋巴细胞增值的影响结果见表3。

组 别吸光度值存活率/%空白组0.761±0.026 100模型组1.054±0.024##138.458给药0.25mg/mL组0.817±0.032△△115.725给药0.5mg/mL组0.730±0.037△△102.102给药1mg/mL组0.587±0.035△△93.955

注：与空白组比较，##P<0．01，与模型组比较，△△P<0．01

3讨论

免疫器官是免疫细胞分化、发育和成熟的场所，免疫器官的增大与减小很大程度上反映了机体的免疫功能。采用2,4-二硝基氟苯造成非特异性迟发型超敏变态反应模型，造模剂量适中，存活率高，以免疫器官指数为考察指标，模型组与空白组差异明显，结果表明淫羊藿水煎液对超敏所致的脾指数增加、耳肿胀，血清中炎症因子IL-2、IL-4含量升高均有显著的回调作用，提示淫羊藿水煎液对超敏反应的显著抑制作用可能是通过改变细胞内信息传导来实现的。

廓清指数是血流中异物被巨噬细胞清除的速率，其廓清指数越大，碳粒廓清能力越强，而碳粒廓清能力又反应单核细胞的吞噬能力，单核细胞的吞噬能力是反映其免疫功能的主要指标之一。本实验以碳粒廓清法分别考察WDE对正常小鼠和环磷酰胺(CY)造成的免疫低下小鼠的免疫系统的调节作用，CY是较强的烷化剂，可杀伤各种免疫细胞，抑制免疫功能，为免疫学研究中常用造模剂。结果表明淫羊藿水煎液对免疫低下小鼠脾脏萎缩有明显的拮抗作用，并可促进单核细胞吞噬功能，在这相同廓清法下，淫羊藿水煎液对正常小鼠的脾系数有下调现象，并对单核细胞廓清指数有明显的降低，这种现象可能是由于淫羊藿在生物免疫应答上存在多水平，多环节的调节功能，其在此模型下表现出来的上调或下调免疫水平的结果，更有力地提示其对免疫系统存在双向调节作用。

脾淋巴细胞是重要的免疫活性细胞，它能被有丝分裂原ConA所激活向淋巴母细胞转化，在转化过程中DNA、RNA及蛋白质合成增加使细胞分裂增殖[7]，采用MTT法考察脾淋巴细胞的增殖程度，可反映机体细胞的免疫功能。Colic M等[8]研究证实，淫羊藿可使之前在体内活化了的淋巴细胞在体外却表现出免疫抑制活性，这也证明了本实验中，高、中剂量淫羊藿水煎液使体外脾淋巴细胞转化增殖能力明显下降这一结果。

在中药临床治疗中发现，许多中药在病理状态下有很好的疗效，但对正常生理状态条件下所起作用并不明显，这是由于病理状态下的药物吸收速度、吸收部位、转化后血药浓度与正常生理状态有很大不同，机体代谢和应激通路反应等亦存在很大差异。因此构建成功的更接近临床应用实际情况的病理模型，无疑具有重要的意义。本实验通过迟发性特异性超敏模型、碳粒廓清法非特异性模型、体外脾淋巴细胞增殖3种模型综合研究淫羊藿水煎液对小鼠免疫系统的影响,造模方法成熟,结果差异明显。研究中不仅成功地造成超敏反应和免疫抑制2种病理状态，而且在碳粒廓清法中分别考察了淫羊藿水煎液对正常小鼠和免疫低下小鼠单核细胞吞噬能力，证明了在正常生理状态下淫羊藿水煎液是没有起到免疫增强作用，甚至出现了抑制，但其对正常机体的免疫保护作用是通过拮抗CY诱导的免疫功能下降来体现的,可以用于临床上化疗药物等易引起免疫功能低下疾病的防治；此外，淫羊藿水煎液对超敏反应小鼠和脾淋巴细胞恶性增殖均有很好的免疫回调和保护作用，不仅对超敏反应下的小鼠免疫器官、耳肿胀，IL-2、IL-4水平有明显的抑制作用，并且对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖有明显的拮抗作用。综合分析各模型后不难发现，淫羊藿水煎液对正常小鼠有轻微免疫抑制作用，对超敏反应小鼠有显著的免疫抑制作用，并对免疫低下小鼠有显著的免疫增强作用，说明淫羊藿水煎液可能对免疫系统具有双向调节作用，但其影响机制的分子学基础尚不十分清楚，有待于进一步对淫羊藿及其提取物进行生物免疫应答方向的研究。

参考文献：

[1]LIAO H-j,CHEN X-m,LI W-g.Effect of epimedium sagittatum on quality of Life and cellular immunity in patients of hemodialysis maintenance[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,1995,15(4):202-204.

[2]CHEN Yu,SHEN Zi-yin,CHEN Wei-hua.Molecular mechanism of epimedium flavonoids in immune homeostasis remodeling in aged rats revealed by lymphocyte gene expression profile[J].Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine,2004,24(1):59-62.

[3]邹萍.淫羊藿免疫药理学研究进展[J].中国中医药科技,2010,17(3):279-280.

[4]孙奕,王景明,骆永珍.淫羊藿总黄酮促进免疫功能低下小鼠IL-2和NK活性的实验研究[J].中草药,2002,33(7):62-64.

[5]王红梅,马玲,吴少平,等.比较两种墨汁注射途径对免疫低下小鼠廓清实验的影响[J].中国食品卫生杂志,2003,4(4):314-316.

[6]胡彦武.东北刺人参茎叶提取物对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(7):156-158.

[7]徐燕萍,胡小庆,湛学军,等.莪术对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].山东医药,2012,52(4):51-53.

[8]COLIC M,DOSLOV-KOKORUS Z,BACKOVIA,et al.Evaluation of the stimulatory effect of Epimedium alpinum L.methanolic extract on the immune response in vivo[J].Die Pharmazie,2007,62(9):705-708.

Interventional effect of water decoction of Epimedium on immune system model of mice at different levels

YANG Xiaoxu,WANG Yu,HAN Zhenai,XUE Di,LIU Shumin*

(Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

Abstract：ObjectiveStudy the comprehensive effect of water decoction of Epimedium(WDE) on immune system of mice by constrcting three immune system model.This study provides the theory basis of clinical treatment for immune system diseases by using traditional Chinese medicine.MethodsThe author investigated the effect of WDE on different immune model by establishing three models.There are delayed type hypersensitivity (DTH) model,normal mice and immunocompromised mice model model evaluated by carbon clearance method,and multiplication of splenic lymphocyte model induced by ConA.ResultsThe coefficient of spleen,IL-2 and IL-4 of hypersensitivity decreased significantly(P<0．01) after giving WDE.Detecting by Carbon clearance method,WDE decreased coefficient of spleen,expurgation index,phagocytic count of normal mice compared with blank group(P<0.05).However,the WDE significant increased coefficient of spleen,expurgation index,phagocytic count of immunocompromised mice compared with model group(P<0.05)which were both given Cy.In addition,WDE can significantly inhibit the spleen lymphocyte proliferation reaction induced by ConA,and its strength are dose dependent.ConclusionThe WDE has the effect of immunosuppression on DTH in mice and normal mice ,and on restrain the malignant proliferation of spleen lymphocytes in vitro,and on enhancing and protecting the immune system in immunocompromised mice obviously.So,the WDE could have two-way adjustment function of the immune system.

Keywords：water decoction of Epimedium(WDE);immune system;regulating effect

(收稿日期:2015-06-11)

文章编号：2095-6258(2016)01-0014-04

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

*通信作者：刘树民，教授，博士研究生导师，电话-(0451)82193278，电子信箱-kji-liu@163.com

作者简介：杨晓旭(1987-)，女，博士研究生，主要从事中药性味理论研究。

基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划)课题(2013CB531804)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.005