BDNF在急性应激所致小鼠空间学习记忆功能改变中的作用

肖婧姗　李洋　李娜　李文荟　崔艳飞　胡晓彤　李亚

【摘 要】目的 研究急性应激对小鼠空间学习记忆功能及脑内BDNF表达的影响。方法 采用足底电击急性应激动物模型，通过Morris水迷宫实验检测试小鼠空间学习记忆能力；以免疫组织化学方法检测脑源性神经营养因子（BDNF）在海马和前脑皮层的表达。结果 与正常对照组小鼠比较，急性应激组小鼠在水迷宫实验中的逃避潜伏期明显缩短（P<0.05， P<0.01），而在目标象限的停留时间显著延长（P<0.05）；急性应激组小鼠海马CA1、CA3区，齿状回和前脑皮层BDNF的表达明显增加（P<0.05，P<0.01）。结论 急性应激导致小鼠空间学习记忆功能增强，这可能与海马和前脑皮层BDNF表达的上调有关。

【关键词】急性应激；空间学习记忆；BDNF；海马；前脑皮层

【Abstract】Objective To study the effects of acute stress on the ability of spatial learning and memory and the expression of brain derived neurotrophic factor （BDNF） in the hippocampus （HP） and prefrontal cortex （PFC） of mice. Methods Using animal model mice induced by single-factor acute stressor （foot shock）. The ability of spatial learning and memory of mice was measured using Morris water maze， and the expressional changes of BDNF in mice brain were detected by immunohistochemical method. Results Compared with control group mice， the escape latency of the acute stress group mice were shorter（P<0.05， P<0.01）， and the swimming time of the platform quadrant of the acute stress group mice were significantly increased in Morris water maze（P<0.05）. The expression of BDNF in the CA1，CA3 region and dentate gyrus of HP and PFC were significantly increased in stress group mice（P<0.05， P<0.01）， compared with control group mice. Conclusion The results indicated that acute stress induced a significant increase in spatial learning and memory ability， and it may be nearly related to the up-regulation of BDNF expression in HP and PFC.

【Key words】Acute stress； Spatial learning and memory； BDNF； Hippocampus； PFC

脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor， BDNF）属于神经营养因子家族，在中枢神经系统中的海马、杏仁核、纹状体和皮层等部位都有丰富的表达，对神经细胞分化、增殖、营养和成熟都具有重要作用。研究表明，BDNF可增强动物脑内神经细胞间的突触联系，从而使学习记忆功能增强[1]。外界环境的改变可引起机体产生应激反应。适度的应激可增强机体的抵抗力和适应能力，对维持机体生存具有重要意义，但持久过度的应激则会导致一系列病理现象产生。海马结构作为边缘系统中的一个重要组成部位，是介导应激反应的最重要脑区之一，参与情绪、学习和记忆、行为等功能的调节[2]。研究表明，动物在急性应激期，相关脑区的神经元仍保持其完整性， 但中枢神经递质系统和神经内分泌系统功能活动加强。在中枢神经系统中，与应激关系密切的脑区除海马外，还有前额叶皮层、杏仁核、纹状体等部位[3]。本研究采用急性应激动物模型，通过Morris水迷宫检测小鼠的空间学习记忆功能的变化，测定小鼠海马和前脑皮层BDNF的表达，以探讨急性应激对小鼠空间学习记忆功能的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

健康昆明品系小白鼠24只，2月龄，体重18-20g，雌雄各半，由山东鲁抗医药公司动物实验中心提供。实验小鼠置于自然昼夜节律光照条件下群养1周以适应环境，每日抚摸抓捉小鼠，使其适应实验人员的操作。将小鼠随机分为正常对照组和急性应激组。急性应激组采用足底电击的单一应激原（电压36V，每隔15s刺激一次，每次持续30s，共30次）；正常对照组动物不接受实验应激原，以同样的条件饲养。

1.2 Morris水迷宫小鼠学习记忆能力检测

急性应激结束后，对正常对照组和急性应激组小鼠进行水迷宫实验。Morris水迷宫测试程序包括定位航行试验和空间探索试验两部分。水迷宫被均等的分为4个象限，平台置于第一象限（目标象限），在水池第三象限周边壁上做明显标志物，与第一象限平台连线为圆形水池一直径。定位航行试验历时2天，每只小鼠每天接受8次找平台训练，分两个训练周期（上午和下午），每个训练周期4次，每次对应一个象限将小鼠入水，每次训练2 min。记录小鼠寻找到隐藏在水面下平台的时间即逃避潜伏期（escape latency）。空间探索试验是在定位航行试验后进行，第3天撤除平台，从第三象限入水点将小鼠放入水中，记录2 min内小鼠在四个象限的游泳时间，检测小鼠对原平台（目标象限）的记忆能力。定位航行试验每个训练周期前以及空间搜索试验前均对应激组小鼠进行足底电击。

1.3 小鼠海马和前脑皮层BDNF的表达

急性应激结束后，对急性应激组和正常对照组小鼠，用0.4%的戊巴比妥钠行腹腔麻醉，当即打开胸腔，暴露心脏，经心快速灌注生理盐水及预冷的多聚甲醛磷酸盐缓冲液，开颅取脑，后固定2小时；梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，行冠状切片（片厚约5 μm）。切片严格按照试剂盒操作说明进行免疫组织化学染色，以PBS（磷酸盐缓冲液）代替一抗作阴性对照，试剂盒购自武汉博士德生物公司。每只小鼠选择海马CA1区、CA3区、齿状回（DG）和前脑皮层（PFC）切片3张，每片各随机取两个视野，利用Motic Images Advanced 3.2图像处理系统测量BDNF阳性神经元平均目标灰度值。

1.4 统计学处理

实验数据以均数±标准差（±s）表示，水迷宫定位航行试验中的逃避潜伏期采用重复测量的方差分析（one-way repeated -measures ANOVA）；空间搜索试验中的各象限游泳时间采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并以LSD法进行组间的两两比较。其他数据的组间比较采用非配对t检验，以P<0.05表示统计学上具有显著性差异。

2 结果

2.1 急性应激后小鼠定位航行学习能力的变化

在两天定位航行试验中，正常对照组和急性应激组小鼠的逃避潜伏期均明显下降；具有显著性差异（F=8.156， P<0.01）；结果显示（表1），与正常对照组比较，在第一天的训练周期以及第二天的第一个训练周期，急性应激组小鼠的逃避潜伏期均缩短，有显著性差异（P<0.01，P<0.05）。结果表明，急性应激后小鼠的小鼠的空间学习能力明显增强。

2.2 急性应激后小鼠空间搜索记忆能力的变化

在空间搜索试验中，正常对照组和急性应激组小鼠均在目标象限（第一象限）停留时间最长（表2）；且均显著长于在其它三个象限的时间（正常对照组小鼠F=9.637， P<0.01；急性应激组小鼠F=6.846， P<0.01）。与正常对照组小鼠比较，急性应激组小鼠在目标象限停留的时间显著延长（P<0.05）。结果表明，急性应激可以明显增强小鼠的空间记忆保持能力以及对空间定位的准确性。

2.3 急性应激后小鼠海马和前脑皮层BDNF表达的变化

免疫组化染色结果显示，急性应激后，与正常对照组小鼠相比，急性应激组小鼠海马CA1区、CA3区、DG和前脑皮层BDNF的表达明显增强；与正常对照组小鼠相比（表3），急性应激组小鼠各脑区GDNF阳性神经元平均目标灰度值显著减少（P<0.01）。

3 讨论

在机体处于不利的环境条件下可产生一系列的应激反应。许多研究报道，适度的应激对机体有利无害，但过强、持久的应激可影响和改变中枢神经系统中与行为相关的神经元形态和功能。有研究报道，当人或动物处于强烈的急性应激或长期慢性应激时，其中枢神经系统的功能可受到明显的影响，特别是引起海马功能的损害，学习记忆能力显著损伤[4]。短暂的急性应激可提高动物的学习记忆能力，但也有研究报道，急性应激可减弱动物的学习记忆[5]，这种差异可能与采用的应激强度及方式不同有关。在脑内，海马、前脑皮层、杏仁核等部位是与应激和学习记忆密切相关的区域。有研究表明，急性应激对海马的形态结构没有明显影响，提示急性应激对中枢神经系统的影响可能只涉及突触传递效能的可塑性变化。在本研究中，急性应激后小鼠的逃避潜伏期明显缩短，且目标象限停留时间显著延长，结果说明急性应激明显增强小鼠的空间学习记忆功能。

BDNF是神经营养因子的一种。有研究报道，BDNF可调控神经细胞的生存、生长、分化和凋亡，增加神经细胞间的突触联系，能有效防止神经元的变性及死亡。因此，它是维持神经元功能和再生修复及防止神经元退行性病变等多方面发挥重要作用的细胞因子[6]。也有研究报道，BDNF对神经元的可塑性也具有一定的影响作用[7]。研究表明，BDNF mRNA高表达区在海马、上丘和大脑皮层，并且在海马内其表达量可达神经生长因子（NGF）的50倍[8]。我们先前的研究表明[9]，慢性应激导致小鼠Morris水迷宫空间学习记忆功能受损，海马各区及前脑皮层BDNF表达降低。而在本研究中，给予小鼠足底电击急性应激后，应激组小鼠的空间学习记忆能力增强，脑海马和前脑皮层BDNF的表达明显增加。结果表明，急性应激后，引起小鼠海马和前脑皮层神经元功能活动发生明显变化。可以推测，BDNF可能参与了急性应激对机体空间学习记忆的影响；急性应激所致小鼠空间学习记忆功能的改变可能与BDNF表达的上调密切相关。

【参考文献】

[1]Mu JS， Li WP， Yao ZB， Zhou XF. Deprivation of endogenous brain-derived neurotrophic factor results in impairment of spatial learning and memory in adult rats[J]. Brain Research， 1999， 835：259-265.

[2]Dranovsky A， Hen R.Hippocampal neurogenesis： regulation by stress and antidepressants[J]. 2006， 59： 1136-1143.

[3]Arnsten AF.Stress signalling pathways that impair prefrontal cortex structure and function[J]. Nature， 2009， 10： 410-422.

[4]Buwalda B，Kole MH，Veenema AH， et al. Long-term effects of social stress on brain and behavior： a focus on hippocampal functioning[J]. Neurosci Biobehav Rev， 2005， 29： 83-97.

[5]Wittner M， Riha P.Transient Hypobaric hypoxia improves spatial orientation in young rats[J]. Physiol Res， 2005， 54： 335-340.

[6]Roceri M， Cirulli F， Pessina C， et al. Postnatal repeated maternal deprivation produces age-dependent changes of brain-derived neurotrophic factor expression in selected rat brain regions[J]. Biol Psychiatry， 2004， 55： 708-714.

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[8]Russo-Neustadt A， Hat， Ramirez R， et al， Physical activty-antidepressnt treatment combinition： impact on brain-derived neurotrophic factor and behavior in an animal model[J]. Behav Brain Res， 2001， 120： 87-95.

[9]徐芸，孔宏，宋倩，等.慢性应激对小鼠空间学习记忆功能及海马和前额叶皮层BDNF表达的影响[J].曲阜师范大学学报，2009，35：85-89.

[责任编辑：杨玉洁]