高通量测序技术及EST-SSR标记在蔬菜研究上的应用

陈兴奎

（辽宁省锦州市农业科学院，辽宁锦州121017）



高通量测序技术及EST-SSR标记在蔬菜研究上的应用

陈兴奎

（辽宁省锦州市农业科学院，辽宁锦州121017）

高通量测序技术又称下一代测序技术（Nextgeneration sequencingtechnology），1次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，与以往的测序技术相比，其特点是通量高、测序成本显著降低、测序时间显著缩短。转录组测序（RNA-seq）是利用高通量测序技术直接对由mRNA逆转录生成的cDNA序列进行测序，产生数以千万计的reads数量，从而使得基因组区域中不同基因的转录水平可以直接通过比对到该基因组区域的reads数来衡量[1]。在已完成基因组测序的物种中，可将RNA-seq结果与基因组DNA序列数据进行对比，从而得到基因表达、可变剪切、基因结构优化、新基因发现等分析结果。对于没有参考基因组的物种，可以进行de novo转录组测序研究，即对所得到测序读长片段进行de novo组装，进而得到该物种的单一基因序列集（unigenes）数据[2]。

迄今，国内外已有多篇关于利用转录组高通量测序技术对植物抗病相关基因进行分析研究的报道。李湘龙等[3]对水稻和稻瘟菌互作早期转录组进行了测定和分析，克隆和鉴定在互作早期表达的稻瘟菌效应蛋白基因，从总计约12.5M条序列标签中分离和鉴定了338942条来源于稻瘟菌的序列，并最终定位到779个稻瘟菌预测基因，其中108个基因很可能参与了水稻和稻瘟菌互作过程，42个基因为预测的分泌蛋白基因。通过RT-PCR分析，最终确认了42个预测分泌蛋白基因中有12个基因在侵染水稻早期有显著的表达，而其中有4个基因表现为侵染早期特异表达。以抗病棉花品种（海岛棉品种7124）和黄萎病菌V991菌株为材料，通过RNA-Seq技术研究了在接种病原菌后棉花植株转录组的变化，筛选到3442个差异表达基因，揭示了转录控制的复杂性，认为木质素和苯丙途径在植株对黄萎病菌的防御反应中发挥了重要作用。王刚[4]通过So⁃lexa高通量测序的方法对盐胁迫处理前后的棉花幼苗进行转录组测序，发现了相当多受盐胁迫处理上调和下调的基因，揭示了棉花幼苗盐处理前后转录组水平复杂的调控网络。Fernandez等[5]提取了感染咖啡锈菌21d后的咖啡叶片的RNA，并反转cDNA，用454转录组测序平台（454GS-FLX Titanium）进行了测序，结果获得了352146条reads，拼接后有22774个contigs，对测序结果分析后发现一些与抗病相关的基因，如PR-5、葡聚糖酶、PR1b、几丁质酶等。在对菜豆（Phaseolusvulgaris L.）利用454转录组测序方法发掘抗病基因序列的研究中发现植物抗病基因大部分都有共同的保守结构域，如NBS、LRR、蛋白激酶（PK）、跨膜结构（TM）和TIR，这些都是R基因的基本结构特征。将转录组测序后获得的169万条序列和GenBank中的116716条ESTs作为参照序列库和已知的70多个R基因比对，最后发现了365条非冗余序列有类似的结构，其中有116 （45.48%）条来自于454转录组测序、147（40.27%）条来自于菜豆的ESTs、52（14.25%）条是两者都有的[6]。

基于转录组测序技术可以大批量开发SSR （Simple sequence repeats）分子标记。SSR是1类1～6个碱基短片段重复的DNA链，是基因或基因组的普通组分。与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态性高、呈共显性遗传、重复性好、数量丰富、易操作、对模板DNA质量要求低及遍布整个基因组等优点。因此，在植物遗传研究的很多方面得以应用[7]。由于基因组SSR没有基因功能，一般和基因组转录区不能紧密连锁，而EST-SSR是和功能基因紧密连锁，甚至它本身就是功能基因的一部分[8]。所以EST-SSR在分子育种标记辅助选择上更为重要。另外EST-SSR来源于物种间保守的表达序列，因此它在相似物种间具有很高的转移性[9]，非常适合于物种间的比较基因组学的研究。随着NCBI数据库中EST序列数目的剧增，越来越多的EST-SSR标记被开发出来，并且被广泛的应用于遗传图谱构建、比较作图、基因定位、DNA指纹图谱构建、生物遗传多样性以及许多物种的进化研究上。目前在动植物中都开发了大量的EST-SSR标记，并在各类研究中进行利用，如葡萄（V.vinifera）、甘蔗（Sacchar⁃umspp.）、硬粒小麦（Triticumdurum）、黑麦（Secale ce⁃reale L）、大麦（Hordeumvulgare L.）、小麦（Triti⁃cumaestivumL.）、水稻（Oryza sativa L.）、马铃薯（So⁃lanumtuberosumL）、香蕉（Musa nana Lour.）、莴苣（Lactuca sativa L.）、鹰嘴豆（Cicer arietinum）、花生（Arachishypogaca）、蓖麻（Ricinus communis L.）、木薯（Manihot esculenta Crantz）、豌豆（Lathyrus sativus L.）、萝卜（Raphanus sativus L.）、辣椒（Capsicumspp.）等。

随着越来越多的重要农作物、栽培品种或模式植物的全基因组被测定，可以预见到不久的将来，科学家们能高效对农作物不同栽培品种进行深入、高效、准确的遗传差异分析、分子标记分析、连锁图谱分析、表观遗传学分析、转录组分析、全基因组关联分析等研究，利用分析结果改进农作物的育种技术，加快新品种的育种研究，从而使现代农业生物技术在提高农作与产量、质量、减少农业成本、保护生态环境等方面大显身手。

参考文献

[1] Ansorge W.J.Next- generation DNA sequencingtech⁃niques[J].N Biotechnol，2009，25（4）:195～203.

[2]岳桂东，高强，罗龙海，等.高通量测序技术在动植物研究领域中的应用[J].中国科学：生命科学，2012，42（2）: 107～124.

[3]李湘龙，柏斌，吴俊，等.第二代测序技术用于水稻和稻瘟病互作早期转录组的分析[J].遗传，2012，34（1）:102～ 112.

[4]王刚.棉花幼苗盐胁迫条件下Solexa转录组测序结果的分析及验证[D].硕士毕业论文，山东农业大学，2011.

[5] Fernandez D.，Tisserant E.，Talhinhas P.，et al.454py⁃ro-sequencingof Coffea arabica leaves infected by the rust fun⁃gus Hemileia vastatrix reveals in planta-expressed pathogen-se⁃creted proteins and plant functions in a late compatible plantrust interaction[J].Molecular Plant Pathology，2012，13:17～37.

[6] Liu Z.，Crampton M.，Todd A.，et al.Identification of

（上接P64）

的发芽杂草可采用药剂防除，如灰菜、马齿苋、荠菜和苣荬菜等；深土层中发芽的杂草如苍耳、鸭跖草和苘麻等，由于其种子在药层以下，应选用土表处理除草剂。

玉米田中禾本科杂草和阔叶杂草大部分混生，给农民选择除草剂类型带来一定的难度。再加上外部主观、客观因素的干扰，大大降低了化学除草剂防除杂草的效果。

4.1客观因素

4.1.1气象因素

（1）湿度：土壤表面过干或过湿，施药后不能形成药土层。（2）温度：温度过高，除草剂挥发、分解量增大，减小了除草剂的实际使用剂量；温度过低，除草剂活性下降，杂草蜡质层增厚，药剂无法正常进入杂草体内。（3）风：大风加速了除草剂的挥发和分解，降低了土壤表层湿度。

4.1.2土质因素

土壤有机质含量高，吸附除草剂能力强，降低了除草剂的有效剂量；土壤盐碱中和与固定部分除草剂，使除草剂剂量相对下降；盐碱地中的碱草耐药性较强。

4.2主观因素

4.2.1除草剂因素

除草剂本身质量问题，如厂家生产工艺不达标，农民买到不合格产品；多元合剂配比不合理，如合剂中乙草胺含量低、2，4-D丁酯含量偏高，除草效果差，常发生药害。

4.2.2人为因素

（1）除草剂选择不合理：没有根据玉米地中杂草群落的数量和种类正确选用除草剂。（2）施药方法不正确：苗前封闭用水量小，遇高温大风天中午施药；苗后用水量大，雾化不好，遇大风天施药等。（3）施药时间不对：苗前封闭处理的杂草在出土后施药，苗后茎叶处理的杂草在4叶以后施药或遇雨施药等。（4）用药量不适宜：杂草密度大、恶性杂草多的地块及盐碱地没有适当增加用药量，低温干旱情况下没有适当加量等。

玉米田化学除草应本着安全、节约、高效的原则选择合适剂型、施药适期、安全有效剂量和正确的施药方法，以确保化学除草防效和对玉米生产的安全。

[1]徐明慧，于晓东.玉米田苗后除草剂的应用[J].农业与技术，2010，30（1）:128～129.

[2]苏少泉.玉米田除草剂新品种与应用[J].农药研究与应用，2009，13（1）:1～6.

[3]邢光耀，魏广太，杨吉峰.烟嘧磺隆和氯氟吡氧乙酸混配防除玉米田杂草及其安全性[J].农药，2008，47（1）:72～ 73，76.expressed resistancegene-like sequences bydataminingin 454-derived transcriptomic sequences of common bean（Phaseolus vulgaris L）[J].BMC Plant Biol，2012，12∶42～51.

[7] Schlotterer C.The evolution ofmolecularmarkers - just amatter of fashion[J].Nat Rev Genet，2004，5∶63～69.

[8] Bozhko M，Riegel R，Schubert R，et al.A cyclophilin⁃ genemarker confirminggeographicaldifferentiation of Norway spruce populations and indicatingviability response on excess soil-born salinity[J].Mol Ecol，2003，12∶3147～3155.

[9] Scott K.D.，Eggler P.，Seaton G.，et al.Analysis of SSRsderived fromgrape ESTs[J].Theor Appl Genet，2000，100∶723～726.