蛹虫草的蚕蛹活体培养和蚕蛹粉培养基培养技术及主要成分的比较分析

蒲 彬 施阳阳 刘燕林 左少纯 吴丽莉

(1新疆和田蚕桑科学研究所，新疆和田 848000; 2新疆和田玉圣科技有限责任公司，新疆和田 848000)

蛹虫草的蚕蛹活体培养和蚕蛹粉培养基培养技术及主要成分的比较分析

蒲 彬1施阳阳1刘燕林1左少纯2吴丽莉1

(1新疆和田蚕桑科学研究所，新疆和田 848000;2新疆和田玉圣科技有限责任公司，新疆和田 848000)

对采用蚕蛹活体注射接种和在小麦+大米+蚕蛹粉混合培养基(以下简称混合培养基)表面喷洒接种蛹虫草菌2种方法培养得到的蚕蛹虫草的主要成分进行了比较分析，结果表明:蚕蛹活体注射接种培养得到的蚕蛹虫草，腺苷含量为184 mg/kg，比混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的腺苷含量(102 mg/kg)高80.39%;氨基酸总量(215 800 mg/kg)比混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草(165 600 mg/kg)高30.31%，必需氨基酸含量(94 200 mg/kg)比混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草(63 900 mg/kg)高47.42%;未检测出铅的含量(低于0.005 mg/kg)，汞的含量(0.012 mg/kg)也低于混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的含量(0.015 mg/kg)，铅、汞的含量远低于食品安全国家标准GB 2762—2012《食品中污染物限量》的限量要求。

蚕蛹虫草;培养基;虫草素;氨基酸;虫草多糖

蛹虫草是著名的食药用真菌，其药理作用和药用成分与冬虫夏草极其相近，其菌体内含有多种营养成分和药用成分，广泛应用于食品、医药、膳食、保健等领域，市场需求量大，具有较高的经济价值［1－3］。新疆和田蚕桑科学研究所从2006年就开始着手进行蚕蛹虫草的培养试验，包括干蛹培养基接种蛹虫草菌试验、活蚕接种蛹虫草菌试验等。本试验是在前期研究的基础上，对蚕蛹活体注射接种蛹虫草菌和小麦+大米+蚕蛹粉培养基(以下简称混合培养基)表面喷洒接种蛹虫草菌培养得到的蚕蛹虫草的主要成分进行了比较分析，试验结果如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试试剂及材料 洋葱、大米、小麦、医用75%消毒酒精均为市售;酵母粉为分析纯;鲜活家蚕蛹和蚕蛹粉均由新疆和田蚕桑科学研究所提供;蛹虫草菌菌种由山东德州东方生物技术研究所提供，并经过试种后活化转接培养而得。

1.1.2 供试仪器设备 SW－CJ－1F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产品;THZ－300型恒温摇床培养箱，江苏太仓试验设备厂产品;LDZX－30KBS型立式灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品;DHG－9076A型电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司产品;JY20002型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司产品;KFR－35GW空调，美的集团股份有限公司产品;LED虫草培养灯，聊城金星食用菌设备有限公司产品;1.5 m的4层培养架，自制;750 mL罐头瓶、1 000 mL虫草培养盒，均为市售。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基制备 (1)液体培养基的制备。按参考文献［4］的方法将洋葱100.0 g、酵母粉5.0 g、蚕蛹粉10.0 g、蒸馏水1 000 mL配制成液体培养基，将配制好的液体培养基200 mL装入容量为500 mL的三角瓶中，三角瓶用透气封口塞封口，放入LDZX－30KBS型立式灭菌锅内121℃灭菌30 min，冷却至室温后放入超净台待用。(2)混合培养基的制备。按参考文献［5］的方法将小麦25.0 g、大米25.0 g、蚕蛹粉5.0 g装入容量为1 000 mL的虫草培养盒中，混合均匀后按料水质量比为1∶1.3加水配制成混合培养基。静置1晚，待培养料充分吸水膨胀后，置于LDZX－30KBS型立式灭菌锅内121℃高温湿热灭菌2 h(或100℃高温湿热灭菌10 h)，待灭菌后的培养料充分冷却后移入接种室待用。

1.2.2 蚕蛹活体接种培养 (1)蚕蛹活体接种用蛹虫草菌的准备。在无菌条件下用接种钩钩取3块长0.5 cm活化后的蛹虫草母种菌丝，移入装有200 mL无菌水的500 mL三角瓶(装有15粒直径4 cm的玻璃珠)内震荡1 min，制成蛹虫草菌菌丝体悬液备用。(2)蚕蛹活体蛹虫草菌的接种。选择化蛹2～3 d的新鲜、健康的蚕蛹，用75%的医用酒精对蚕蛹体表快速进行消毒后，用1 mL微量注射器吸取蛹虫草菌菌丝体悬液，按每头蚕蛹注射16.7 μL(1 mL菌丝体悬液约接种60头蚕蛹)对蚕蛹进行注射接种，注射接种好的蚕蛹盛于培养盘内，平铺1层，注射接种约1万头活蛹。(3)僵化培养。将注射接种了菌丝体悬液的蚕蛹移入预先消毒好的房间，保持室内温度20℃，相对湿度60%，进行黑暗培养，保持每日室内通风1 h，同时室内设置灭虫灯等设备，防止蚊蝇等有害生物侵害蛹体，经过7～10 d，蛹体内逐渐被蛹虫草菌侵染，蛹体僵化。(4)菌丝体培养。蛹体僵化后对其进行整理，剔除被污染的腐败蚕蛹，将未被污染的僵化的蛹体装入750 mL的罐头瓶内，铺满750 mL罐头瓶瓶底底面1层，不要重叠，盖保湿透气盖或覆盖保鲜膜，室内保持温度20℃，培养瓶内相对湿度约85%，经过4 d左右，可从蛹体的节间褶皱处看到有菌丝长出蛹体，蛹虫草菌菌丝体培养完成。(5)子实体原基培育。将盛有完成蛹虫草菌菌丝体培养的蛹体的750 mL罐头瓶移入装有LED虫草培养灯的培养架上，通过调节光照、温差、气流等方式促进菌丝转色和子实体原基的形成，经过4 d左右的培育，形成子实体原基。(6)出草管理。在蛹体形成子实体原基后，保持培养室室内温度20℃，培养瓶内相对湿度约85%，每日例行通风换气，600 Lx左右散射光照射8 h，经过30 d左右的培养，子实体培养完毕，为保证最佳营养成分，需在蛹虫草菌孢子粉形成前进行采收，采收完毕后于60℃烘干至含水率15%以下后低温避光保存。

1.2.3 混合培养基培养 (1)液体培养基菌种的培养。在无菌条件下用接种钩钩取3块长0.3 cm的活化后的蛹虫草母种菌丝移入装有200 mL液体培养基的三角瓶中，放入THZ－300型恒温摇床培养箱中，在 20℃下静置培养 24 h后，在转速为120 r/min、温度为18℃的条件下振荡培养5 d，当培养液中出现菌丝球时，再培养2 d即可以在试验中使用。(2)混合培养基蛹虫草菌的接种。在无菌条件下将1.2.3项“(1)液体培养基菌种的培养”获得的液体培养基菌种用快速搅拌器搅拌以破碎菌丝球，防止因菌丝球体积过大堵塞接种枪，然后用无菌水将破碎了菌丝球的液体培养基菌种稀释10倍，用接种枪吸取3 mL破碎了菌丝球的液体培养基菌种均匀地喷洒到1.2.1项“(2)混合培养基的制备”获得的混合培养基表面。(3)菌丝体培养。将喷洒接种了液体培养基菌种的培养盒移入发菌室，控制发菌温度为18～20℃，并且保证每日通风换气2 h，经过10 d左右的黑暗培养，蛹虫草菌菌丝完全深入培养料，完成菌丝体培养。(4)子实体原基培育。将完成菌丝体培养的培养盒移入装有LED虫草培养灯的培养架上，开盖套保鲜膜，并且在保鲜膜上扎1～3个小孔，通过调节光照、温差、气流等方式刺激菌丝体转色和子实体原基形成，经过10 d左右的培育，菌丝体完成转色，形成子实体原基。(5)出草管理。菌丝体完成转色、形成子实体原基后，保持培养室室内温度20℃，相对湿度85%，每日例行通风换气，800 Lx左右散射光照射8 h，经过45 d左右的培育，子实体培育完毕，为保证蛹虫草最佳营养成分，需在蛹虫草菌孢子粉形成前进行采收，采收完毕后于60℃烘干至含水率15%以下后低温避光保存。

1.2.4 成分检测 将蚕蛹活体注射接种培养和混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草子实体各800 g(固态，含水率为15%)送谱尼测试中心(北京)实验室，分别依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)［6］、GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》［7］、GB/T 5009.17—2003《食品中总汞及无机汞的测定》［8］、GB 5009.12—2010《食品中铅的测定》［9］进行药用活性成分(虫草素等)、营养成分(氨基酸)、重金属(铅、汞)等的检测。

2 结果与分析

2.1 腺苷等药用活性成分含量

从表1可以看出，蚕蛹活体注射接种培养得到的蚕蛹虫草，腺苷含量为184 mg/kg，比混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的腺苷含量(102 mg/kg)高80.39%;但虫草多糖(1 800 mg/kg)的含量比混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的虫草多糖含量(2 400 mg/kg)低25.00%，虫草素(8 954 mg/kg)的含量也略低于混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草(9 403 mg/kg)，而且因检测时操作不当未检测到虫草酸。

表1 蚕蛹活体注射接种和混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的活性成分含量 mg/kg

2.2 氨基酸含量

从表2可以看出，蚕蛹活体注射接种培养得到的蚕蛹虫草，除了酪氨酸(Tyr)的含量略低于混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草外，其余17种氨基酸含量均高于混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草，氨基酸总量比混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草高30.31%，必需氨基酸比混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草高47.42%。

表2 蚕蛹活体注射接种和混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的氨基酸含量 mg/kg

2.3 重金属含量

从表3可以看出，蚕蛹活体注射接种培养得到的蚕蛹虫草，未检测到铅的含量，汞的含量(0.012 mg/ kg)也低于混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的含量(0.015 mg/kg)。而且这2种蚕蛹虫草的重金属(铅、汞)含量均远低于食品安全国家标准GB 2762—2012《食品中污染物限量》［10］的限量要求。

表3 蚕蛹活体注射接种和混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的重金属含量 mg/kg

3 小结与讨论

检测结果表明:用新疆和田蚕桑科学研究所提供的蚕蛹活体注射接种培养和混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草均含有大量的营养及功效成分。蚕蛹活体注射接种培养得到的蚕蛹虫草，除未检到虫草酸、虫草多糖略低外，其他营养及功效成分均高于冬虫夏草和柞蚕蛹虫草［11－12］;而混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草，除虫草素较高外，其他营养及功效成分均低于冬虫夏草和柞蚕蛹虫草［11－12］。当然检测机构、试验方法不同可能导致不同的检测结果，具体这几种虫草的营养及功效成分含量在相同试验方法、相同检测机构的检测结果，有待进一步试验研究。但是，从食品安全的角度考虑，用新疆蚕蛹活体注射接种和混合培养基表面喷洒接种培养得到的蚕蛹虫草的重金属含量(铅、汞)远低于国家对食用菌及其制品的规定，值得推广。在今后的工作中，我们将继续进行蚕蛹虫草的高产、深加工、药用活性成分、有害微生物等方面的研究。

参考文献

［1］张平，朱述钧，钱大顺，等.北冬虫夏草功能成分及保健作用分析Ⅲ［J］.江苏农业科学，2003，31(6):105－107.

［2］都兴范，李亚杰，王林华，等.北冬虫夏草的研究发展现状［J］.辽宁农业科学，2003，44(4):26－28.

［3］包建忠，蒋宁，陈秀兰，等.北冬虫夏草规模化生产技术研究与示范推广［J］.现代农业科学报，2009，16(1):69－73.

［4］蒲彬，施阳阳，刘燕林，等.蛹虫草培养基碳源和氮源对菌丝生长的影响［C］//中国蚕学会，国家蚕桑产业技术体系，浙江省湖州市农业科学研究院，等.全国蚕桑资源多元化利用学术研讨会论文集.湖州:［出版者不详］，2014:150－153.

［5］施阳阳，蒲彬，刘燕林，等.蛹虫草人工培养的营养基质配方的优化试验［C］//中国蚕学会，国家蚕桑产业技术体系，浙江省湖州市农业科学研究院，等.全国蚕桑资源多元化利用学术研讨会论文集.湖州:［出版者不详］，2014:154－157.

［6］佚名.保健食品检验与评价技术规范(2003年版)［M］.北京:中华人民共和国卫生部，2003.

［7］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.食品中氨基酸的测定:GB/T 5009.124—2003［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［8］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.食品中总汞及无机汞的测定:GB/T 5009.17—2003［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［9］中华人民共和国卫生部.食品中铅的测定:GB 5009.12—2010［S］.北京:中国标准出版社，2010.

［10］中华人民共和国卫生部.食品中污染物限量:GB 2762—2012［S］.北京:中国标准出版社，2012.

［11］都兴范，李军，米锐，等.蛹虫草和冬虫夏草主要活性成分含量比较［J］.食用菌，2010，32(6):61－62.

［12］钟石，李有贵，陈诗，等.人工培养蛹虫草与冬虫夏草的主要活性成分比较［J］.蚕业科学，2009，35(4):831－836.

S886.9

B

1007－0982(2016)03－0041－04

10.16839/j.cnki.zgcy.2016.03.010

2016－04－27;接受日期:2016－07－04

新疆维吾尔自治区科研机构创新发展专项资金项目(编号2013012);现代农业产业技术体系建设专项(编号CARS－22)。

第1作者信息:蒲彬(1982—)，男，四川绵竹，本科，农艺师。Tel:0903－2091071，E-mail:pubin1@163.com