转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的变化及其机制

胡可可，刘小敏，宋泓，于渊毅

(1郴州市第一人民医院，南华大学附属郴州医院，湖南郴州 423000；2南华大学肿瘤研究所)



转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇敏感性的变化及其机制

胡可可1，刘小敏2，宋泓1，于渊毅1

(1郴州市第一人民医院，南华大学附属郴州医院，湖南郴州 423000；2南华大学肿瘤研究所)

目的 观察转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性变化，并探讨其机制。方法 培养卵巢癌SKOV3细胞，将SKOV3细胞分为观察组、对照组、单药组，三组均经0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇处理，观察组转染miR-101类似物，对照组转染无关序列，单药组不转染任何序列，MTT法观察各组细胞增殖能力，AnnexinV-FITC/PI法测算各组细胞凋亡率。采用Western blotting法检测25 ng/mL紫杉醇注射液作用的观察组、对照组、单药组细胞DNMT3A蛋白。结果 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液作用的观察组细胞OD值分别为0.632±0.014、0.554±0.012、0.503±0.015、0.428±0.011、0.346±0.006、0.301±0.007，单药组分别为0.718±0.013、0.687±0.015、0.619±0.011、0.554±0.009、0.473±0.008、0.420±0.011，对照组分别为0.713±0.016、0.671±0.011、0.626±0.010、0.549±0.008、0.467±0.010、0.412±0.008，观察组与对照组相比，P均<0.05。0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液作用的观察组细胞凋亡率分别为9.63%±0.38%、14.71%±0.64%、21.27%±0.79%、27.05%±0.92%、31.82%±1.07%、35.51%±1.63%，单药组分别为3.61%±0.24%、6.18%±0.48%、9.57%±0.42%、15.64%±0.75%、18.79%±1.12%、22.05%±1.34%，对照组分别为3.74%±0.29%、6.02%±0.35%、10.63%±0.58%、15.21%±0.84%、19.37%±1.26%、23.30%±1.18%，观察组与对照组相比，P均<0.05。观察组、对照组、单药组细胞中DNMT3A蛋白相对表达量分别为0.427±0.068、0.961±0.107，0.947±0.113，三组比较，P<0.05。结论 转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性增强，miR-101可能通过靶向调控DNMT3A诱导卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。

微小RNA-101类似物；卵巢癌细胞；甲基化转移酶3A；紫杉醇；药物敏感性

紫杉醇是广泛用于治疗卵巢癌的化疗药物，尽管卵巢癌患者在最初应用紫杉醇为基础的化疗方案上取得了一定的效果,但最终易对其产生抗药性[1]。目前研究[2,3]已证实，一些机制参与紫杉醇抗药性，如多药转运体P-糖蛋白表达上调、微管蛋白同型抗原的选择性表达、Bcl-2的表达下调以及异常的细胞信号通路。然而，紫杉醇耐药的整体分子机制至今仍然尚未完全阐明。microRNA(miRNA)是一类内源性、非编码RNAs分子，其通过抑制靶基因mRNA的活性或转录，从而沉默该基因的表达。miRNA在不同的细胞学过程中发挥重要作用，如细胞的增殖、分化以及凋亡，可作为肿瘤诊断与预后分子标志物[4]。近年来，越来越多的研究关注miRNA在药物抵抗或药物敏感性中的作用，大量的研究表明miRNA通过调控相关靶蛋白，包括药物转运蛋白、细胞凋亡调节因子以及细胞周期相关复合物等，从而影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。miR-27a[5]、miR-106a[6]、miR-487[7]通过调控不同靶基因的表达影响药物抵抗的发展。miR-101在多肿恶性肿瘤中表达下调并起类似于抑癌基因样作用[8,9]。前期研究[10]表明，miR-101通过靶向调控DNMT3A抑制人卵巢癌细胞生长与侵袭，是否会影响卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性尚未见报道。本研究观察了转染miR-101模拟物后人卵巢癌细胞株SKOV3对紫杉醇的敏感性，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞株SKOV3由中山大学肿瘤研究所惠赠；Lipofectamine2000购于美国Invitrogen公司；MTT购于美国Sigma公司；miR-101模拟物(5′-UACAGUACUGUGAUAACUGAA-3′)和无关序列(5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′)均由Exiqon公司设计合成；紫杉醇注射液由郴州市第一人民医院肿瘤科提供；DNMT3A和β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司；PRIM1640培养基和小牛血清购自Gibco公司。

1.2 紫杉醇处理及细胞分组方法 培养卵巢癌SKOV3细胞，将细胞分为观察组、对照组、单药组，按2 mL/孔接种于6孔板中，培养细胞汇合度达50%，分别将0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液加至6孔板中，继续培养卵巢癌SKOV3细胞48 h，用于转染。用灭菌的无酶水稀释各种转染质粒干粉，按说明配制成20 μmol/L的溶液备用。用不含血清的Opti-MEM培养液分别稀释100 pmol转染质粒与5 μL的Lipofectamin2000，混匀，室温孵育5 min。观察组转染miR-101模拟物，对照组转染无关序列，单药组不转染任何序列，培养48 h，收获细胞。

1.3 卵巢癌SKOV3细胞增殖检测 采用MTT法。分别将上述三组SKOV3细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，培养至临近90%汇合度，每孔加灭菌MTT液(5 mg/mL)20 μL，继续孵育4 h后取出，然后每孔再加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min，选择波长为570 nm，在酶标仪上测定各孔OD值，记录结果，实验重复3次。OD值代表细胞增殖能力。

1.4 卵巢癌SKOV3细胞凋亡检测 采用AnnexinV-FITC/PI法。收集上述各组处理并培养至80%左右汇合度细胞，用PBS液洗涤细胞2次，离心，取约1×106个细胞，加入100 μL的结合缓冲液悬浮细胞。加5 μL Annexin V-FITC混匀，再加1 μL的PI混匀。室温下避光反应15～30 min，上机，流式细胞仪检测。结果判定：以AnnexinV为横轴，PI为纵轴；左上象限为机械性损伤细胞，右上象限为晚期凋亡细胞或者坏死细胞，左下象限为正常细胞，右下象限为早期凋亡细胞，细胞凋亡率为右上与右下两者细胞数之和与总细胞数比值。

1.5 卵巢癌SKOV3细胞DNMT3A蛋白检测 采用Western blotting法。选择25 ng/mL紫杉醇注射液作用的观察组、对照组、单药组细胞。收集并提取三组SKOV3细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定细胞蛋白浓度，100 ℃水浴10 min，取等量的总蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳，并转至PVDF膜上。TBST洗膜，用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后分别加入鼠抗人DNMT3A单克隆一抗，4 ℃封闭过夜。去除一抗，TBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白荧光检测试剂盒显示结果于X线片。扫描蛋白定量，计算结果。

2 结果

2.1 各组细胞OD值比较 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液作用的观察组细胞OD值分别为0.632±0.014、0.554±0.012、0.503±0.015、0.428±0.011、0.346±0.006、0.301±0.007，单药组分别为0.718±0.013、0.687±0.015、0.619±0.011、0.554±0.009、0.473±0.008、0.420±0.011，对照组分别为0.713±0.016、0.671±0.011、0.626±0.010、0.549±0.008、0.467±0.010、0.412±0.008，观察组与对照组相比差异有统计学意义(P均<0.05)，单药组与对照组相比差异无统计学意义。

2.2 各组细胞凋亡率比较 0、6.25、25、100、400、1 600 ng/mL紫杉醇注射液作用的观察组细胞凋亡率分别为9.63%±0.38%、14.71%±0.64%、21.27%±0.79%、27.05%±0.92%、31.82%±1.07%、35.51%±1.63%，单药组分别为3.61%±0.24%、6.18%±0.48%、9.57%±0.42%、15.64%±0.75%、18.79%±1.12%、22.05%±1.34%，对照组分别为3.74%±0.29%、6.02%±0.35%、10.63%±0.58%、15.21%±0.84%、19.37%±1.26%、23.30%±1.18%，观察组与对照组相比差异有统计学意义(P均<0.05)，单药组与对照组相比差异无统计学意义。

2.3 各组DNMT3A蛋白表达比较 观察组、对照组、单药组卵巢癌细胞中DNMT3A蛋白相对表达量分别为0.427±0.068、0.961±0.107，0.947±0.113，三组比较，P<0.05。

3 讨论

卵巢癌是妇科肿瘤中恶性程度最高的一种肿瘤，其病死率在全球女性中居第二位[11]。由于缺乏特异性早期症状和可靠的早期诊断方法，卵巢癌早期诊断率非常低。因而，手术加术后辅助性化疗是卵巢癌的主要治疗模式。然而，化疗药物的毒副作用以及癌细胞对化疗药物抵抗极大降低了治疗的有效性[12]。因此，进一步研究卵巢癌的发生发展机制，以寻找与开发有效的靶向治疗药物成为当务之急。

大量的研究表明,miRNA在不同的生物学过程中发挥重要作用，如细胞增殖、凋亡、新陈代谢以及肿瘤的形成[13]。近年来，越来越多的研究关注miRNA在逆转药物的耐药性与调节肿瘤细胞对化疗药物敏感性方面的作用。研究[14]发现，多种miRNA在卵巢癌中表达失调，如miR-30c、miR-130a、miR-335在卵巢癌中表达下调，并且直接参与化疗药物抗药性的发展过程。miR-21在卵巢癌中表达下调不仅能促进卵巢癌细胞发生凋亡，并且还能调节癌细胞对化疗药物的敏感性[15]。在卵巢癌中，miR-141通过直接靶向KEAP1基因诱导顺铂对癌细胞产生抵抗[16]，而miR-21-3p通过靶向NAV3基因诱导紫杉醇对癌细胞产生抵抗[17]。而另一方面，一些miRNA高表达能增强化疗药物的敏感性。He等[18]研究显示，miR-152能增强卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。而Zhou等[19]研究报道，miR-449a通过下调NOTCH1能增强紫杉醇诱导的细胞毒性。由此可见，不同的miRNA通过靶向不同的基因在卵巢癌中发挥不同的作用。

研究显示，miR-101在胃癌[8]、结肠癌[9]、乳腺癌[20]以及前列腺癌[21]中表达下调，并且通过靶向调控不同基因的表达发挥不同生物学作用。如miR-101通过靶向Stathmin可抑制乳腺癌细胞生长与转移[20]。miR-101通过靶向调控EZH2可抑制前列腺癌干细胞增殖[21]。miR-101通过靶向调控EP4可抑制结肠癌细胞迁移与侵袭[9]。可见miR-101在多种肿瘤中具有抑癌作用。紫杉醇是从红豆杉树皮中提取的具有抗癌作用的天然广谱抗肿瘤药物，可促进细胞微管蛋白聚合、维持已聚合微管蛋白的稳定、抑制细胞有丝分裂，从而实现抗癌效应[22]。紫杉醇是一种细胞毒性化疗药物，常用于卵巢癌的治疗，不良反应主要为骨髓抑制、心脏毒性、超敏反应等。本研究通过MTT实验发现，经不同浓度紫杉醇作用后卵巢癌SKOV3细胞的增殖能力逐渐下降，而miR-101与不同浓度紫杉醇作用后卵巢癌SKOV3细胞的增殖能力下降尤为显著。凋亡实验显示，经不同浓度紫杉醇作用卵巢癌SKOV3细胞后，细胞的凋亡率逐渐增加，而miR-101与不同浓度紫杉醇作用卵巢癌SKOV3细胞后，细胞的凋亡率增加尤为显著。上述结果提示，miR-101能增强紫杉醇的增殖抑制与诱导凋亡的作用。DNMT3A是miR-101直接调控的靶基因[23]，是一种从头甲基转移酶，主要调节哺乳动物CpG甲基化。高甲基化水平使抑癌基因沉默，从而导致肿瘤的发生。大量研究表明，DNMT3A在乳腺癌[24]、肝癌[25]、胃癌[26]等恶性肿瘤中高表达。作为miR-101的靶基因，DNMT3A是否参与了miR-101对紫杉醇的抗癌敏感性调节呢？本研究检测了miR-101与紫杉醇对DNMT3A蛋白表达影响，发现转染miR-101类似物卵巢癌细胞DNMT3A蛋白表达水平较对照组、单药组下降显著。

综上所述，转染miR-101类似物后卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性增强，miR-101可能通过靶向调控DNMT3A诱导卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。

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Sensitivity change of ovarian cancer cells transfected with miR-101 analogues to paclitaxel

HUKeke1,LIUXiaomin,SONGHong,YUYuanyi

(1ChenzhouNo.1people'sHospital,ChenzhouHospitalAffiliatedtoUniversityofSouthChina,Chenzhou423000,China)

Objective To observe the sensitivity change of ovarian cancer cells transfected with miR-101 analogues to paclitaxel, and to explore its mechanism. Methods Ovarian cancer cells SKOV3 were cultivated and divided into 3 groups: the observation group, control group and single drug group. Three groups were treated with 0, 6.25, 25, 100, 400 and 1 600 ng/mL paclitaxel. The observation group was transfected with miR-101 mimics, control group was transfected with unrelated sequence and single drug group was not transfected with any sequence. MTT was conducted to observe the proliferation ability of cells in each group. Annexin V/propidium iodide staining was employed to detect the apoptosis rate in each group. Western blotting was employed to detect the protein expression of DNMT3A in these three groups which were respectively treated by 25 ng/mL paclitaxel.Results The OD values of the observation group were 0.632±0.014, 0.554±0.012, 0.503±0.015, 0.428 ± 0.011, 0.346±0.006 and 0.301±0.007, respectively. The OD values of the single drug group were 0.718 ±0.013, 0.687±0.015, 0.619±0.011, 0.554±0.009, 0.473±0.008 and 0.420±0.011, respectively. The OD values of the control group were 0.713±0.016, 0.671±0.011, 0.626±0.010, 0.549±0.008, 0.467±0.010 and 0.412±0.008, respectively. The differences were of statistical significance between the observation group and control group (allP<0.05). The apoptosis rates of the observation group were 9.63%±0.38%, 14.71%±0.64%, 21.27%±0.79%, 27.05%±0.92%, 31.82%±1.07%, 35.51%±1.63%, respectively. The apoptosis rates of the single drug group were 3.61%±0.24%, 6.18%±0.48%, 9.57%±0.42%, 15.64%±0.75%, 18.79%±1.12% and 22.05%±1.34%, respectively. The apoptosis rates of the control group was 3.74%±0.29%, 6.02%±0.35%, 10.63%±0.58%, 15.21 %±0.84%, 19.37%±1.26% and 23.30%±1.18%, respectively. The differences were of statistical significance between the observation group and control group (allP<0.05). The expression of DNMT3A protein in the observation group, control group and single drug group were 0.427±0.068, 0.961±0.107 and 0.947±0.113, respectively. The differences were of statistical significance among these three groups (P<0.05). Conclusion MiR-101 analog can increase the sensitivity of ovarian cancer cells to paclitaxel through targeted-regulating DNMT3A.

miR-101 analogues; ovarian carcinoma cells; methylation transferase 3A; paclitaxel; drug susceptibility

国家自然科学基金资助项目(81101988)。

胡可可(1979-)，女，副主任医师，主要从事妇科肿瘤的研究。E-mail: 2638419564@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.004

R737.31

A

1002-266X(2016)35-0013-04

2016-03-09)