HPLC法同时测定马兜铃中4种成分

田禾苗， 程雪梅，2， 王长虹，2*， 王峥涛，2（.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点实验室，上海2020；2.上海中药标准化研究中心，上海2020）



HPLC法同时测定马兜铃中4种成分

田禾苗1， 程雪梅1，2， 王长虹1，2*， 王峥涛1，2
（1.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点实验室，上海201210；2.上海中药标准化研究中心，上海201210）

摘要：目的 建立同时测定马兜铃Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.中马兜铃酸III、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ的HPLC方法。方法 马兜铃70%甲醇提取液的分析采用Agi1ent Extend C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃，检测波长254 nm。结合大鼠口服马兜铃酸I的半数致死量（LD50）及细辛药材中马兜铃酸I的限量，确定马兜铃中马兜铃酸的限量。结果 马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ分别在0.34～31.90、0.32～30.20、0.12～28.10和0.21～41.30 μg/mL范围内线性关系良好。马兜铃中马兜铃酸Ⅰ或马兜铃总酸的限量为0.000 3%。结论 该方法准确可靠，可用于马兜铃中马兜铃酸的限量测定。

关键词：马兜铃；马兜铃酸Ⅲ；7-羟基马兜铃酸Ⅰ；马兜铃内酰胺Ⅰ；马兜铃酸Ⅰ；LD50；限量；HPLC

Aristo1ochic acidⅢ，7-hydroxy aristo1ochic acidⅠ，aristo1ochia 1actamⅠand aristo1ochic acidⅠexhibited good 1inear re1ationships within the ranges of 0.34 -31.90 μg/mL，0.32 -30.20 μg/mL，0.12 -28.10 μg/mL and 0.21 -41.30 μg/mL，respective1y.The dose 1imitation of aristo1ochic acidⅠor tota1aristo1ochic acids in A.debilis was determined to be nomore than 0.000 3%.C0 NCLUSI0 N This accurate and stab1emethod can be used for the 1imitation determination of aristo1ochic acid in A.debilis.

KEY W 0RDS：Aristolochia debilis Sieb.et Zucc；aristo1ochic acidⅢ；7-hydroxy-aristo1ochic acidⅠ；aristo1ochia 1actamⅠ；aristo1ochic acidⅠ；LD50；dose 1imitation；HPLC

马兜铃为马兜铃科植物北马兜铃Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果实，具有清肺降气、止咳平喘、清肠消痔之功效［1］，其化学成分有马兜铃酸、生物碱、木脂素、甾体、萜类等，以马兜铃酸类成分为主。同时，马兜铃酸类成分又可分为马兜铃酸和马兜铃内酰胺两大类［2］，前者主要有马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等，而后者主要为马兜铃内酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa等。现代研究表明，马兜铃具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、镇痛等药理作用［3］，但长期服用含马兜铃酸的药物可能造成慢性肾衰竭以及肾小管病变。其机制是与DNA形成加合物，马兜铃酸在体内经简单代谢过程后，其胺离子将被硝基还原酶还原为环内酰胺离子［4］，一部分代谢产物被还原为马兜铃内酰胺，进入肾小管上皮细胞、蓄积于细胞质内发挥毒性作用［5］，而另一部分则与DNA中嘌呤核苷酸的环外氨基共价结合，形成特异性AA-DNA加合物［6］，进而使IAS基因和p53基因发生突变。

近年来，长期服用含马兜铃酸的药物所造成的副作用已引起国际社会的高度关注，并冠以“中草药肾病”，对中医药的健康发展产生了严重的影响。1999年，英国药物安全委员会（CSM）建议应立即禁止使用含有马兜铃的中草药，同时英国医药管理局（MCA）也提交了一项关于禁止可能含有马兜铃的中草药在英国进口、销售和供应的禁令，并进行表决，结果自1999年7月至10月在全英范围内暂时性禁用相关产品，但不久就延续为无限期禁用［7］。因此，《中国药典》从2005年版起，已不再收录关木通、广防己、青木香等含有马兜铃的中药方，并以其他品种替代，而且对其他含马兜铃酸生药的药用部位也进行了更改。例如，2000年版以前的《中国药典》中细辛药用部位均为“全草”，但后来考虑到其地上部分马兜铃酸含有量较高，而且古代中医一直仅使用根部，《日本药局方》也仅用“根和根茎”，所以从2005年起《中国药典》亦将药用部位修订为根和根茎；《中国药典》2010年版进一步规定，依照HPLC法测定，按干燥品计算细辛中马兜铃酸Ⅰ的含有量不得过0.001%［8］，但相关鉴别项下只对马兜铃酸Ⅰ进行薄层鉴别［1］，而有关马兜铃中马兜铃酸类成分的限量尚无规定，为其安全使用带来了一定的安全隐患。为了严格控制马兜铃药材质量，保证用药安全，本实验建立了同时测定马兜铃中马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ含有量的HPLC法，并根据马兜铃酸I的相关毒性数据（LD50）推定限量，为其安全标准的制定奠定基础。

1 仪器与试药

Agi1ent 1100高效液相色谱仪，包括Agi1ent ChemStation中文色谱工作站；KQ-250DB数控超声波清洗仪；Mett1er 200电子天平；Agi1ent Extend C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ对照品（上海盛中医药化工有限公司，纯度均＞95%）；马兜铃内酰胺Ⅰ（天津士兰科技有限公司，纯度＞98%）；马兜铃酸Ⅰ对照品（上海中药标准化研究中心，纯度≥98%）。乙腈、甲酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。15批马兜铃药材购自黑龙江、辽宁、新疆、湖南、陕西、四川等多个产区的药房及中药材市场，由上海中药标准化研究中心吴立宏研究员鉴定，其性状均与《中国药典》2010年版规定一致，故为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agi1ent Extend C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～35 min，24%～30%A；35～50 min，30%～55%A；50～60 min，55%A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长254 nm。在该色谱条件下，各检测组分的分离度良好，见图1。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 对照品溶液的制备 马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ分别精密称取马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ适量，加甲醇制成每1 mL含0.16 mg马兜铃酸Ⅲ、0.15 mg 7-羟基马兜铃酸Ⅰ、0.14 mg马兜铃内酰胺Ⅰ、0.20 mg马兜铃酸Ⅰ的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 精密取本品细粉（过四号筛）0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声（250 W、40 kHz）60 min，放冷，再称定重量，70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 含有量测定方法 分别吸取对照品与供试品溶液20 μL，注入HPLC色谱仪，在“2.1”项条件下，外标一点法测定马兜铃酸Ⅲ、7-OH马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ的含有量。

2.5 线性关系的考察 精密吸取“2.2”项下对照品溶液，配置成含31.90、25.50、19.10、12.70、6.40、3.20、0.32 μg/mL马兜铃酸Ⅲ，30.20、24.20、18.10、12.10、6.00、3.00、0.30 μg/mL 7-羟基马兜铃酸I，28.10、22.40、16.80、11.20、5.62、0.30、0.10 μg/mL马兜铃内酰胺Ⅰ和41.30、33.10、24.80、16.50、8.25、2.08、0.21 μg/mL马兜铃酸Ⅰ的混合对照品溶液，进样20 μL分析。结果表明，各成分在相应的范围内线性关系良好，具体见表1。

表1 4种成分的线性关系和范围Tab.1 Linear relationships and ranges of four consitutents

2.6 精密度试验 精密吸取高、中、低3种不同质量浓度的对照品溶液各20 μL，连续进样6次，分别计算马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ和马兜铃酸Ⅰ的日内、日间精密度。结果，4种成分峰面积的日内、日间精密度ISD均≤3%，表明仪器精密度良好，具体见表2。

2.7 重复性试验 精密称取1号样品细粉0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行6份，测得马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ和马兜铃酸Ⅰ的平均含有量分别为0.13%、 0.02%、0.02%、0.08%，ISD分别为0.81%、1.9%、1.9%、0.90%，表明该方法重复性良好。

表2 4种成分的日内、日间精密度Tab.2 Intra-day and inter-day precisions of four consitutents

2.8 稳定性试验 精密吸取供试品溶液20 μL，于0、1、3、8、12、18、24、36 h进样，测定马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ和马兜铃酸I峰面积的ISD分别为0.59%、0.87%、2.7%、2.0%，表明供试品溶液在36 h内稳定。

2.9 加样回收率试验 精密称取含有量已知的马兜铃药材（1号）9份，每份0.25 g，分别按含有量的80%、100%、120%加入对照品溶液，平行3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，计算加样回收率，结果见表3。

2.10 含有量测定结果 见表4。

表4 4种成分含有量的测定结果Tab.4 Determ ination results of the contents of four constituents

表3 加样回收率试验结果Tab.3 Results of recovery tests

2.11 马兜铃酸的限量研究 查阅文献［9］，得到了NMI I小鼠（美国马里兰贝赛斯达鼠）和Wistar大鼠在灌胃给予马兜铃酸（77.24%马兜铃酸Ⅰ和21.18%马兜铃酸Ⅱ钠盐的混和溶液）后的LD50，见表5。

由表可知，不同种属动物服用马兜铃酸后，其LD50差别较大，由Wistar大鼠转化后的含有量上限约为NMI I小鼠的4倍。但为了严格控制马兜铃中总酸的含有量，本实验采取了由NMI I雄性小鼠转化后的含有量上限作为马兜铃中马兜铃酸Ⅰ的含有量上限（雄性NMI I小鼠口服马兜铃酸的LD50为55.9 mg/kg，LD5为LD50的1/19，即2.94 mg/kg。人与小鼠的剂量换算比例为1∶9.1，即LD5换算成人的致毒剂量为0.32 mg/kg）。以人LD5剂量的1/10为安全剂量上限，按平均体重60 kg计算，并以马兜铃药材最大服用量9 g计，计算出马兜铃药材中马兜铃酸Ⅰ的含有量不应超过0.02%。

表5 NMRI小鼠和W istar大鼠的LD50及限量Tab.5 LD50and dose lim itations of NMRIm ice and W istar rats

同时，还测定了马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ的含有量，但由于现有文献并未这3种成分的LD50进行报道，故无法对其的含有量上限做出精确限定。据报道，其他马兜铃酸类化合物，如马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲa、马兜铃酸ⅠVa等毒性和马兜铃酸Ⅰ相比，可能更大［10］。因此，用马兜铃酸Ⅰ的毒性代替其它3种马兜铃酸类成分具有一定的合理性，即采用4种马兜铃酸的总和进行限量控制是可行的。因此，暂定马兜铃药材及饮片中马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ的总量不得超过0.02%。

细辛也为含马兜铃酸类成分的药材，《中国药典》2010年版规定，其中马兜铃酸Ⅰ的含有量不得超过0.001%［8］。因此，细辛和马兜铃的用量分别为1～3 g和3～9 g，故推算马兜铃药材或饮片中马兜铃酸I或马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ的总量均不得超过0.000 3%。

3 讨论

3.1 指标成分的选择 马兜铃酸类成分是马兜铃药材中的主要有毒成分，又包括马兜铃酸和马兜铃内酰胺两大类。其中，马兜铃酸Ⅰ是最常见的马兜铃酸类化合物，存在于几乎所有的马兜铃属植物中，而马兜铃内酰胺Ⅰ作为次生代谢产物，普遍存在于马兜铃属各科植物中［11］。因此，以马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ为指标成分，能更加全面地评价和控制马兜铃的毒性。3.2 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器，在190～400 nm波长下对供试品和对照品溶液中的成分进行全波长扫描。结果，马兜铃酸Ⅲ的最大吸收波长在254 nm下为强吸收；7-羟基马兜铃酸Ⅰ在215 nm和275 nm下都有很强的紫外吸收，并且在300～320 nm处为强吸收肩峰；马兜铃内酰胺Ⅰ在235、254、290 nm下都有强吸收；马兜铃酸Ⅰ的最大吸收峰在225、254、330 nm处。因此，为了同时测定这4种马兜铃酸类成分，选择254 nm波长处为佳。3.3 供试品溶液制备方法的选择 本实验分别考察了不同比例甲醇和纯水对马兜铃药材中马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ和马兜铃酸Ⅰ提取效率的影响。结果表明，以70%甲醇提取时，4种成分的提取效率均最高。同时，还比较了超声提取和甲醇回流提取对其提取率的影响，但发现两种方法下马兜铃内酰胺Ⅰ的峰面积均逐渐增加，可能是因为其他不稳定的马兜铃酸类成分受热转化为马兜铃内酰胺Ⅰ，但超声提取增加的幅度小于回流提取。因此，为了确保马兜铃内酰胺Ⅰ的准确检测，最终选择超声提取60 min。

3.4 马兜铃酸限度的选择 鉴于马兜铃药材的毒性，根据其用量和文献报道马兜铃酸Ⅰ的相关毒性数据（LD50）及细辛药材中马兜铃酸Ⅰ的限量，推定马兜铃药材中马兜铃酸的限量，为其安全标准的制定奠定基础。按照小鼠口服马兜铃酸Ⅰ后的LD50和药典规定的马兜铃药材最大剂量，推算出马兜铃药材及饮片中马兜铃酸Ⅲ、7-羟基马兜铃酸Ⅰ、马兜铃内酰胺Ⅰ、马兜铃酸Ⅰ的总含有量均不得超过0.02%。但是，如果按照同为含马兜铃酸类成分的细辛中马兜铃酸I的限量为0.001%［8］计算，马兜铃药材和饮片中该类成分的限量应定不得超过0.000 3%。本实验所有样品中总马兜铃酸类成分或马兜铃酸Ⅰ的含有量均超过0.02%或0.000 3%，故建议《中国药典》对马兜铃药材制定合理的限度标准。

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Simultaneous determ ination of four constituents in Aristolochia debilis by HPLC

TIAN He-miao1， CHENG Xue-mei1，2，WANG Chang-hong1，2*， WANG Zheng-tao1，2

（I.Instituteof ChineseMateria Medica，ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine；Key Laboratory of theMinistry of Education for Standardization of Chinese Medicine；Key Laboratory of the State Administration of Traditional Chinese Medicine for New Resources and Quality Evaluation of Chinese Medicine；Shanghai2OI2IO，China；2.Shanghai Research and Development Center for Standardization of ChineseMedicine，Shanghai2OI2IO，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish an HPLCmethod for the simu1taneous determination of aristo1ochic acidⅢ，7-hydroxy-aristo1ochic acidⅠ，aristo1ochia 1actamⅠand aristo1ochic acidⅠin Aristolochia debilis Sieb.et Zucc. METH 0 DS The ana1ysis of 70% A.debilis methano1ic extract was performed on Agi1ent Extend C18co1umn （4.6 mm×250 mm，5 μm），with acetonitri1e（A）-0.1% formic acid（B）as themobi1e phase in a gradient e-1ution manner at1.0 mL/min for f1ow rate，30℃for co1umn temperature and 254 nm for detection wave1ength. Then the dose 1imitation of aristo1ochic acid in A.debilis was determined with reference to themedian 1etha1 dose （LD50）of aristo1ochic acid Iora11y administered to rats and its dose 1imitation in Asurum uropeum.RESULTS

*通信作者：王长虹（1964—），男，研究员，博士生导师，研究方向为中药新制剂与体内过程。Te1：（021）51322511，E-mai1：wchcxm@163.com

作者简介：田禾苗，男，硕士生，研究方向为中药新制剂与体内过程。Te1：15221230656，E-mai1：tianhemiao123456@hotmai1.com

基金项目：《中国药典》2010版标准提高研究项目（508）

收稿日期：2015-10-30

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.017

中图分类号：I284.1

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2016）03-0560-06