非诺贝特对卵形鲳鲹PPAR α及CPTI基因表达的影响

方玲玲，陈　刚,2,3，王忠良,2,3，汤保贵,2,3，张健东，黄建盛，周　晖（.广东海洋大学水产学院 //2.广东省普通高校 南海水产经济动物增养殖重点实验室 //3.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东　湛江 524088）



非诺贝特对卵形鲳鲹PPAR α及CPTI基因表达的影响

方玲玲1，陈刚1,2,3，王忠良1,2,3，汤保贵1,2,3，
张健东1，黄建盛1，周晖1
（1.广东海洋大学水产学院 //2.广东省普通高校 南海水产经济动物增养殖重点实验室 //3.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江 524088）

摘要：对卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）腹腔注射20、50、100 mg/kg的激动剂非诺贝特，用RT-PCR检测肝脏、肌肉中PPAR α和CPTI基因表达的变化趋势，研究激动剂对卵形鲳鲹PPAR α和CPTI基因表达的影响。结果表明，PPAR α基因表达量50 mg/kg非诺贝特组高于其他组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），而CPTI表达量在20 mg/kg组有较高的表达水平（P ＜ 0.05）；50 mg/kg非诺贝特组中PPAR α基因表达量随着时间的变化呈现先降低后恢复至初始水平的趋势，CPTI表达量随时间变化先升高后降低，随后又升高的变化趋势，肝脏组织中，CPTI表达量在注射后30 h达到最高（P ＜ 0.05），而在肌肉组织中18 h时达到最高值（P ＜ 0.05）；非诺贝特组PPAR α和CPTI基因的表达量均高于PBS对照组（P ＜ 0.05）。非诺贝特可诱导PPAR α基因的表达，但CPTI与PPAR α基因表达无较明显的相关性。

关键词：卵形鲳鲹；基因表达； PPAR α；CPTI；非诺贝特；RT-PCR分析

过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator activated receptors,PPAR s）是配体激活的核转录因子，有PPAR α、PPAR β及PPAR γ 3种亚型，其中PPAR α调控生物体的脂肪代谢，尤其对参与脂肪酸β氧化的多种酶类基因表达具有调控作用[1-2]。PPAR α具有棕榈酸、油酸、花生四烯酸类代谢产物白三烯和前列腺素类等天然配体，以及氯贝特(Clofibrate)、非诺贝特(Fenofibrate)、WYl4643等人工化合物配体，这些配体作为激动剂可激活PPAR α进而调控与其相关基因的表达[3-4]。近年来，已有哺乳类[5-6]、鸟类[7-8]、鱼类[9-10]PPAR α的研究，PPAR α配体相关研究也主要用于有关PPAR α疾病药物的开发[11-12]。贝特类药物是从氯贝丁酯衍生出来的一组化合物，可降低肝脏极低密度脂蛋白(VLDL)分泌，加强清除血浆甘油三酯（TG）[13-14]。祝庆[12]研究发现，非诺贝特可上调大鼠动脉壁组织中PPAR α表达水平，有效降低血脂水平，牛透明等[15]也证实了非诺贝特的降脂作用，可能诱导wister 大鼠脂蛋白脂酶（Lipoprteinlipase,LPL）活性升高和PPAR α基因表达，但鲜见鱼类方面的相关研究。笔者以卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）为研究对象，腹腔注射微量非诺贝特，观察不同药物剂量下PPAR α及其调控的目的基因CPTI表达的变化趋势，探讨非诺贝特对二基因表达的影响以及PPAR α与CPTI表达的相关性，旨在探寻一种避免鱼类脂肪过度蓄积的诱导剂，为鱼类肉质形成等分子机制的深入研究提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料

健康卵形鲳鲹取自广东海洋大学海洋生物研究基地，120尾，体质量（30 ± 1.0）g；非诺贝特（力平之），法利博福尼制药公司；Trizol试剂、EasyScript反转录试剂盒、TransStart荧光定量试剂盒，北京全式金生物有限公司；ABI7500荧光定量PCR仪，美国ABI公司；引物由生工生物（上海）有限公司合成。

1.2方法

1.2.1实验分组及样品采集取卵形鲳鲹40尾随机分为4组，每组鱼10尾，参照文献[4,11-12，15-16]中的非诺贝特剂量，每尾卵形鲳鲹分别腹腔注射20、50、100 mg/kg的非诺贝特以及PBS缓冲液（对照组）200 μL，于注射后12、24 h取样，各浓度组每次取鱼5尾冷冻麻醉处死，快速分离肝脏和肌肉组织，于液氮中速冻后，转入- 80 ℃条件下保存备用。

另外，取卵形鲳鲹80尾，随机分为2组，实验组每尾鱼腹腔注射浓度为50 mg/kg的非诺贝特200 μL，对照组注射同剂量的PBS缓冲液。分别在注射后6、12、18、24、30、36、42、48 h取样，两组每个时间点分别取5尾鱼的肝脏和肌肉组织于-80℃条件下保存备用。

1.2.2总RNA的提取及cDNA第一链的合成取- 80 ℃保存的各组织约100 mg，按照UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒中推荐的方法提取、纯化总RNA。按照EasyScript反转录试剂盒推荐的体系，以Oligo(dT)18为引物，按照42 ℃ 1 h、85 ℃ 5 min的步骤来合成cDNA第一链。

1.2.3实时荧光定量PCR分析根据卵形鲳鲹PPAR α cDNA序列（GenBank登录号KP893147）和CPTI基因cDNA序列（GenBank登录号KP987456）设计特异性引物PPAR α（A）和PPARα（S），CPTI（A）和CPTI（S），以卵形鲳鲹β-actin为内参基因，设计引物β-actin(A)、β-actin（S）（表1）。实验操作按照TransStart Tip Green qPCR试剂盒的使用方法，在ABI7500实时荧光定量PCR仪上进行RT-PCR反应。每个样品均设3个复孔，进行3组平行反应。PPAR α反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，52.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环；72 ℃ 5 min。CPTI反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，51 ℃ 30 s，72 ℃30 s，40个循环；72 ℃ 5 min。通过与β-actin基因的比较，运用ΔΔCT方法计算卵形鲳鲹肝脏、肌肉组织中PPAR α和CPTI基因的相对表达量2-ΔΔCT，实验数据采用SPSS19.0进行单因素显著性分析和Duncan多重性比较。

表1　引物序列Table 1　Primer Sequences

2　结果与分析

2.1总RNA质量检测

提取的总RNA样品经10 mg/mL琼脂糖凝胶电泳显示清晰的28S和18S rRNA条带（图1），微量核酸定量仪测定其D（260 nm）/D（280 nm）值在1.8～2.0之间，说明提取的总RNA完整性良好，可以用于下一步实验。

图1　肝脏与肌肉的总RNAFig.1　Total RNA from liver and muscle

2.2非诺贝特浓度组PPAR α和CPTI的基因表达

在肝脏组织中（图2），PPAR α表达量与注射后12 h相比，24 h时20、50 mg/kg组升高，50 mg/kg组变化最大。100 mg/kg组表达量各时间点均较高，明显高于PBS对照组（P ＜ 0.05），50 mg/kg组则仅24 h时高与PBS组。而CPTI表达量各非诺贝特组12 h时均低于24 h，而对照组则相反；20 mg/kg组12 h时表达量明显远高于其他各组（P ＜ 0.05），至24 h时各组表达量均低于PBS对照组（P ＜ 0.05）。

图2 不同药物浓度下肝脏PPAR α和CPTI基因表达量Fig.2　Relative expression analysis of PPAR α and CPTI gene in liver with different concentrations of fenofibrate solution

在肌肉组织中，不同非诺贝特浓度下卵形鲳鲹PPAR α和CPTI基因的相对表达量不同。图3表明，PPAR α表达量由高到低依次总体上是50 mg/kg、PBS、20 mg/kg、100 mg/kg组。24 h时20、50 mg/kg组表达量相对于12 h时升高。50 mg/kg与100 mg/kg组间表达差异各时间点均有统计学意义（P ＜ 0.05）。CPTI基因在20 mg/kg的浓度下相对表达量最高（P ＜ 0.05），50 mg/kg组次之，100 mg/kg与PBS组相当（P ＞ 0.05）。24 h 时20、50 mg/kg组表达量相对于12 h时降低。

图3 不同药物浓度下肌肉PPAR α和CPTI基因表达量Fig.3　The relative expression analysis of PPAR α and CPTI gene in muscle with different concentrations of fenofibrate solution

2.3不同时间PPAR α和CPTI的基因表达

肝脏组织PPAR α和CPTI表达量见图4。图4可见，非诺贝特组PPAR α表达量随时间大体上呈先缓慢降低再恢复至初始水平的趋势（12 h时表达量明显降低，可能是由RNA提取、反转录或者实时荧光定量操作过程时的失误导致了RNA降解或其他原因所致），各时间点均高于PBS对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明50 mg/kg非诺贝特可有效促进PPAR α的表达。同样，CPTI表达量各组亦有差别，非诺贝特组CPTI表达量在0～12 h内升高，12～24 h内降低，随后快速升高，在注射后30 h达到最高（P ＜ 0.05），然后呈缓慢下降趋势（图4）。除24 h外，各时间点50 mg/kg组的CPTI表达量均高于PBS对照组（P ＜ 0.05），表明非诺贝特可有效促进CPTI基因的表达。

图4　50 mg/kg非诺贝特对卵形鲳鲹肝脏中PPAR α 和CPTI基因相对表达量的影响Fig.4　Relative expression analysis of PPAR α and CPTI gene in livers with 50 mg/kg fenofibrate solution

肌肉组织PPAR α和CPTI表达量见图5。图5可见，非诺贝特组PPAR α表达量随时间变化先降低后升高（图5），各时间点均明显高于PBS对照组（P ＜ 0.05）；而CPTI则随时间变化先升高，18 h时达到最大值，后又降低，各时间点表达量均明显高于PBS对照组（P ＜ 0.05）（图5）。因此，50 mg/kg的非诺贝特可有效促进肌肉中PPAR α和CPTI基因的表达。

图5　50 mg/kg非诺贝特对卵形鲳鲹肌肉中PPAR α 和CPTI 基因的相对表达量的影响Fig.5　The relative expression analysis of PPAR α and CPTI gene in muscles with 50 mg/kg fenofibrate solution

3　讨 论

PPAR α是核受体超家族的一员，具有多种生物学效应，可通过调控脂肪酸氧化过程中脂蛋白脂酶（LPL）、肉碱棕榈酰基转移酶I、II（CPTI、CPTII）、脂肪酸转运蛋白（FATP-1）等[13-14,17]酶类来调节脂肪酸代谢，进而调节机体血脂含量[18-19]。PPAR α与其配体相互作用调节目的基因的表达主要通过以下环节进行：首先，PPAR α与饱和/不饱和脂肪酸及其衍生物等天然配体或者贝特类（Fibrate）和噻唑烷二酮类（TZDs）等人工合成配体结合，激活PPAR α，并与9-顺式视黄醇X受体（RXR）结合形成异质二聚体，接着与目的基因的启动区的PPAR特异性反应元件（peroxisome proliferator responsive element，PPRE）结合，发挥转录调控作用[16,20-23]。非诺贝特是PPAR α的人工合成配体之一，是化学合成的苯氧酸衍生物类药物，早已获美国批准，并被广泛用于临床降血脂，其安全性已得到大量临床数据支持，研究发现其降血脂的作用主要是通过PPAR α来调控脂肪代谢相关基因表达[24]来实现的。本研究以卵形鲳鲹为研究对象，以非诺贝特为PPAR α配体来诱导PPAR α表达，通过观察PPAR α和CPTI基因的相对表达量，寻找一种可以诱导食物中的脂质转化为能量，避免鱼类脂肪过度沉淀蓄积的诱导剂[16]。结果表明，50 mg/kg的非诺贝特对卵形鲳鲹肌肉组织的PPAR α基因诱导作用显著，在肝脏组织中，100 mg/kg组诱导作用亦较佳。PPAR α的相对表达量随时间先降低后恢复至初始水平，提示非诺贝特对PPAR α的诱导作用可能是一种反馈调节的作用方式。

CPTI是线粒体脂肪酸β氧化的一种“限速酶”，主要调控长链脂肪酸穿过线粒体膜进行β氧化，是脂质转化为能量的关键酶。CPTI基因的启动区上游存在PPRE应答元件，其表达受PPAR α的调控[25-26]。本研究中，在非诺贝特剂量为20 mg/kg时，CPTI的相对表达量较高，且在非诺贝特剂量为50 mg/kg时，随着时间的变化，CPTI的相对表达量呈先升后降之后又升高的变化趋势，在肝脏组织中，CPTI表达量在注射后30 h达到最高值，而肌肉组织中的CPTI在注射后18 h有最高表达量。在适量浓度的非诺贝特作用下，卵形鲳鲹PPAR α和CPTI的表达量总体上均高于PBS对照组，可认为该药物对二基因表达均有上调作用，但二基因的表达量之间随时间变化却无明显的相关性，猜测PPAR α对CPTI的调控可能通过更为复杂的途径发生作用，PPAR α在非诺贝特的诱导下对CPTI进行调控的具体机制尚有待进一步研究。

4　结　语

本研究表明，适宜浓度的非诺贝特均可上调PPAR α和CPTI基因的表达，PPAR α的表达随时间变化表现出反馈调节的作用。CPTI基因的表达与PPAR α基因表达间无明显的相关性，或许显示其基因的表达是一个更为复杂的调控过程。可见，合适浓度的非诺贝特可作为避免鱼类脂肪过度沉淀蓄积的候选诱导剂，通过注射作用于鱼体，诱导脂肪代谢相关基因PPAR α和CPTI的表达来调控脂质转化为能量，维持鱼体营养代谢平衡，改善鱼肉品质。当然，尚需进行一系列非诺贝特相关的毒性机理研究，才有望最终应用于养殖实验中。

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（责任编辑：刘庆颖）

Effects of Fenofibrate on Relatively Expression of Gene PPAR α and CPTI

FANG Ling-ling1,CHEN Gang1,2,3,WANG Zhong-liang1,2,3,TANG Bao-gui1,2,3,ZHANG Jian-dong1,HUANG Jian-sheng1,ZHOU Hui1
（1.Fisheries College of Guangdong Ocean University //2.Key laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquaculture Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes Laboratory of Fish Aquaculture //3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088,China）

Abstract:The fenofibrate solution with concentration of 20,50,100 mg/kg were injected into the abdomen of Trachinotus ovatus respectively,and the expression of gene PPAR alpha and CPTI in livers and muscles were analyzed by RT-PCR,and the effects of the agonists on relatively expression of PPAR α and CPTI gene was studied.The result showed that the expression of PPAR α in group 50 mg/kg is significant higher than that in other groups(P ＜ 0.05),and CPTI had higher expression in group 20 mg/kg(P ＜ 0.05).The expression of PPAR α and CPTI gene had no significant difference in PBS group(P ＞ 0.05),but the expression of PPAR α in group 50 mg/kg firstly increased and decreased and then returned to the initial level trend finally as time changed.Meantime,thebook=14,ebook=17expression of CPTI gene fell after rose and then rose at last as the time gone by.The highest expression appeared at 30 h after injection in livers and the highest expression appeared at 18 h in muscles(P ＜ 0.05).The expression of gene PPAR alpha in livers and muscles with fenofibrate solution is higher than that with PBS.In conclusion,the fenofibrate can induce the expression of PPAR α,but the correlation of the expression between PPAR α and CPTI is not obviously.

Key words:Trachinotus ovatus; gene expression; fenofibrate; PPAR α; CPTI; RT-PCR

通信作者：陈刚（1961－），男，教授，研究方向为鱼类种子工程与增养殖。E-mail：cheng@gdou.edu.cn

基金项目：国家海洋公益性行业科研专项（201205028）；广东省海洋经济创新发展区域示范专项（GD2012-A01-007，GD2012-A02-003）；广东省教育厅创新计划专项（2012KJCX0063）；广西科技厅科技计划（桂科攻1222013-2）

收稿日期：2015-08-17

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.003

中图分类号：Q786

文献标志码：A

文章编号：1673-9159（2016）01-0013-06

第一作者：方玲玲（1990－），女，硕士研究生，研究方向为鱼类种子工程与生物学。E-mail：1176950041@qq.com