壬基酚围产期暴露对子代大鼠的肝毒性及机制探讨

何丽婷，高凤，俞捷，王攀，张恒，许洁

(1遵义医学院公共卫生学院，贵州遵义563000;2遵义医学院附属医院;3遵义市第一人民医院)



壬基酚围产期暴露对子代大鼠的肝毒性及机制探讨

何丽婷1，高凤1，俞捷1，王攀2，张恒3，许洁1

(1遵义医学院公共卫生学院，贵州遵义563000;2遵义医学院附属医院;3遵义市第一人民医院)

目的观察壬基酚(NP)围产期暴露对子代大鼠的肝毒性，并探讨其可能的机制。方法 将成功交配的32只孕鼠随机分为4组，每组8只，NP低、中、高剂量组分别予以NP 50、100、200 mg/kg加玉米油灌胃，对照组予以等容量玉米油灌胃；单笼饲养，空腹灌胃自受孕第6天起至生产后第21天止。仔鼠出生第60天麻醉后内眦取血，剖取肝脏；电镜观察肝细胞超微结构，免疫组化法检测肝组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)，高效液相法色谱法检测血清NP。结果 NP低、中、高剂量组仔鼠肝细胞核内染色质聚集，核膜深染，胞质中有大量的脂滴，且大部分脂滴与溶酶结合，染色较深，且剂量越高表现越明显。仔鼠肝组织TNF-α阳性表达的积分光密度、血清NP水平对照组

壬基酚；围产期暴露；子代大鼠；肝毒性；肿瘤坏死因子α

壬基酚(NP)是一类具有模拟雌激素并与体内雌激素受体结合而干扰机体内分泌代谢，导致健康危害效应的环境内分泌干扰物(EEDs)。目前研究显示，NP能对生物体产生广泛的不良作用，包括生殖和发育[1]、心血管系统和神经系统[2]等。有研究表明，NP被摄入后主要经肝脏清除，肝脏可能是NP作用的主要靶器官[3，4]，并造成肝脏微细解剖结构的损伤[5]，同时可能对仔鼠的肝脏有毒性作用[6],但目前有关NP的肝毒性机制研究较少。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种具有广泛生物学功能的细胞因子，肝细胞表面含有丰富的TNF-α受体[7]，TNF-α与肝脏炎症活动性及肝细胞坏死程度密切相关[8]。2015年5～12月，我们检测了NP围产期暴露大鼠仔鼠肝脏组织中TNF-α的表达，分析其与血清NP水平的相关性，初步探索NP肝毒性的机制。

1　材料与方法

1.1材料清洁级SD雌性大鼠32只，动物合格证号：SCXK(渝)20070005；99% NP(东京化成株式会社)，精制花生油(山东鲁花牌)；TNF-α一抗为兔抗鼠亲和纯化抗体、兔抗鼠TNF-α多克隆抗体、二抗羊抗兔IgG抗体(北京中杉金桥生物科技有限公司)；正己烷-乙醚提取剂(体积比7∶3)，氯仿，异丁醇，75%乙醇等实验室常备试剂均为国产分析纯。高效液相色谱仪(Agilent 1100)；色谱柱：Eclipse XD8-CI8、150 mm×460 mm、5 μm石蜡切片机(美国Agilent公司)；普通光学/荧光显微成像系统(德国徕卡公司)。

1.2分组与处理将32只大鼠成功交配后随机分为4组，每组8只；NP低、中、高剂量组分别予以NP 50、100、200 mg/kg加玉米油 5 mL/kg灌胃，对照组予以等容量玉米油灌胃；单笼饲养，空腹灌胃自受孕第6天起至生产后第21天止。仔鼠出生后常规哺乳喂养，哺乳期后常规饲养。

1.3指标观察仔鼠出生第60天麻醉后内眦取血，剖取肝脏。取部分肝脏组织行铀铅双染色，电镜下观察肝细胞超微结构。常规制作肝组织石蜡切片，采用免疫组化法检测肝组织TNF-α表达，按试剂盒说明书操作。以胞质中出现棕黄色颗粒为TNF-α阳性细胞。每张切片在10×40倍显微镜下选取肝脏视野，采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件测量TNF-α阳性表达的积分光密度(IOD)值。取血常规离心取血清，高效液相色谱法检测血清NP水平。

1.4 统计学方法采用SPSS22.0统计软件。各组间比较用单因素方差分析，两两比较行SNK检验；相关性分析采用Pearson分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组仔鼠肝细胞超微结构比较对照组仔鼠肝细胞核大而圆，核膜清晰，核内染色质均匀分布，胞质中细胞器形态正常，且分布均匀，有少量脂滴存在。NP低、中、高剂量组仔鼠肝细胞核内染色质聚集，核膜深染，胞质中有大量的脂滴，且大部分脂滴与溶酶结合，染色较深，且剂量越高表现越明显。

2.2各组仔鼠肝脏组织TNF-α表达量比较NP低、中、高剂量组仔鼠肝脏组织TNF-α表达的IOD值分别为1 738.99±52.57、2 509.81±32.55、3 096.15±54.01，均高于对照组的79.91±14.72(P均<0.01)；并且NP剂量越高，仔鼠肝脏组织TNF-α表达的IOD值越高(P均<0.01)。

2.3 各组仔鼠血清NP水平比较NP低、中、高剂量组仔鼠血清NP水平分别为(0.43±0.01)、(1.36±0.08)、(2.00±0.30)μg/mL，均高于对照组的(0.04±0.00)μg/mL(P均<0.01)；并且NP剂量越高，仔鼠血清NP水平越高(P均<0.01)。

2.4仔鼠肝脏组织TNF-α表达量与血清NP水平的关系相关分析显示，仔鼠肝脏组织TNF-α表达量与血清NP水平呈正相关(r=0.92,P<0.01)。

3　讨论

NP作为一种表面活性剂，被运用于化工业、农业等数十领域。研究表明，NP是一种具有全身毒性的EEDs[9，10]，具有明显的生物累积性，在水生动物肝脏的蓄积系数达到40～100倍。马全祥等[5]研究表明，小鼠自由饮用1% NP溶液第10天后，光镜下可见小鼠肝脏肝小叶内出现明显灶状坏死，并有炎症浸润，但对其所致肝脏毒性机制的研究较少。

TNF-α是一种具有广泛生物学功能的多肽类细胞因子，参与内毒性休克、炎症、免疫调节、细胞增生、细胞毒性和抗病毒等过程。TNF-α作为炎性反应的始动因子，能在细胞核亚细胞水平上激发一系列级联或瀑布效应，诱导TNF-α等多种炎症因子的上调[11～14]。肝细胞受损后可产生大量的抗原应答反应，使单核细胞、巨噬细胞等被激活，从而分泌大量的TNF-α，与肝细胞上TNF-α受体结合损伤肝细胞。TNF-α还与肝血窦内皮细胞上的受体结合，促使中性粒细胞的趋化和脱颗粒，进一步导致肝损伤。本研究结果显示，NP低、中、高剂量组仔鼠肝细胞核内染色质聚集，核膜深染，胞质中有大量的脂滴，且大部分脂滴与溶酶结合，染色较深，且剂量越高表现越明显。说明围产期行NP暴露可对仔鼠产生肝毒性。仔鼠肝组织TNF-α、血清NP水平对照组

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国家自然科学基金资助项目(81360439，81560527)；贵州省教育厅青年基金(黔教合KY字2013-198)；贵州省科技厅联合基金(黔科合LH字2014-7543)；贵州省大学生创新基金(2016)；遵义医学院招标课题(2013F-68，2015F-784)；遵义医学院大学生创新基金(20155011)。

许洁(E-mail: xujie360@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.009

R575.1

A

1002-266X(2016)34-0025-03

2015-12-24)