体内和细胞内的活性物种的测定方法

李菲

自由基和其他活性O、N、Cl粒子，被广泛认为对于许多与年龄有关的病的发展有作用。或者，它甚至可以通过氧化和氧化损害对老化过程本身起作用。许多研究已经显示，对于老年痴呆症病人脑中所有主要种类生物分子的不断增加的氧化损害，其他氧化损害牵涉到的疾病，包括癌症、动脉硬化症以及其他神经退化疾病和糖尿病。在这篇报道中，我们将调查测定活性物种的可行性方法，并特别强调对人类研究的应用。

许多诱人的技术，例如，L-谱带具有硝酰探针的电子自旋共振成像自旋陷阻，在所有动物中直接测定活性物种还有待发展。但是目前为止，还没有探针适合人类使用。大部分活性物种在体内仅仅持续很短的时间，并且无法直接测定。有几个例外：包括H2O2（下面将讨论），或者还有NO。在某种意义上NO2-浆液水平已经被要求脉管合成。

基本上有两种方法来检测短暂的活性物种：

●尝试去阻止这些物种并测定这些被阻物种的水平。

●测定由活性物种引起的损害的水平，那就是说，氧化损害的量。

有些时候，也会用其他的方法。他们包括测定红血球抗氧化损害和所有抗氧化物在体内的流动活性，这些参数的降低常常作为氧化胁迫的证明。红血球不能合成蛋白质。然而，他们的抗氧化酶的水平随着他们在循环中的老化也会下降。因此，他们含量的变化更能够反映出血液中红细胞在更新中的变化。如果这个变慢了，循环的红血球将在平均水平上变老化，并且抗氧化酶水平也将表现出降低趋势。反之亦然，如果一种变化加速了血红细胞的消除或者是增加了红细胞生成素，红细胞中抗氧化成分的水平将上升。然而，这样的数据应该谨慎阐述。

介于用于测定它的方法，尽管不同的方法测定不同的物种，血浆或血清的总体抗氧化能力通常包括来自尿酸和白蛋白的主要贡献。因此，例如，如果血浆白蛋白的水平下降了，TAC将降低，如果尿酸水平上升了，TAC将上升。血液中化学的多重变化发生在病人身上就意味着TAC变化谨慎说明了。TAC也同样会受饮食影响，通常因为某食物的消耗可能会在血浆中或尿酸水平上产生变化。

唯一的能直接和详细地“看见”自由基的技术是电子自旋共振，因为它能检测出未成对电子的存在。然而，ESR仅能检测相对不太活泼的原子团。因为活泼的原子团不能积累到一个足够高的水平上来被测定。解决这个问题的一个方法是增加陷阻或探针，来拦截自由基，同它们反应来形成一个稳定的基团，它能够被ESR检测到。全身ESR技术用于动物身上，但是现在由于缺少关于探针在人体上的安全数据，因此，现在无法应用于人类。很广范围的陷阻是可以用于动物和细胞组织的，不仅仅是试验过和测试过的N-叔丁基-α苯基硝酸灵和5，5-二甲基-1-吡咯啉，N-氧化物，还有像1，1，3-三甲基-异吲哚，N-氧化物，DECPO，EPPN，DEPMPO，BMPO之类相对的新物质。潜在的问题由Rosen以及其他人综述概括了。一个通常未得到正确评价的问题是反应产品给予ESR的信号能迅速的在体内和培养的细胞中消除，通过酶代谢或直接由VC等物质降低。例如，当DMPO用于阻止OH-时，任何抗坏血酸盐的出现都能够直接减少DMPO-OH-加合物的量到ESR检测不到的水平。许多文献已经提出了多种复合物抗氧化反应的例证，在基团产生体系的存在下，当化合物同DMPO或其他自旋陷阱加合时，通过测定ESR信号的减少这个结果在体外评定出的。这些文献很少报道关键控制：增加的复合物是否会与产生原子团的系统发生冲突，分解H2O2或与Fe2+/H2O2鳌合，或者它是否直接与自旋陷阻加合物反应，把它降低到ESR检测不到的物种。

Rizzi及其他人已经引进了三甲基自由基，TAMOXO63，在含水条件下作为探测O2-的探针。在这种情况下，O2-同探针反应导致了ESR信号的丢失。TAMOXO63的一个优点是它不受如Vc或降谷胱甘肽这类物质降低的控制。

探测器的宽系列可以用来研究许多细胞项目，比如说pH变化，离子运动、识别各种各样的细胞器。例如CCA的增多往往伴随着氧化胁迫的提高。许多报纸杂志称RS的产生可影响离子探针，或者离子探针对RS的形成有贡献。比如说钙黄绿素[69]线粒体追踪器，一种用来鉴定线粒体的荧光探针，能刺激线粒体ROS的产生。

不管你用什么方法来追踪活性物种或测定氧化性损伤，都必须考虑以下几个方面：这个方法怎么操作，怎样合成和它能达到什么样的规模、数量。充分理解了这几点，错误可以降低到最少并且自由基研究的活力领域可以继续向前推进。

编辑 董慧红