荧光法测定果蔬中叶酸含量的研究

王　梦，张加玲

(山西医科大学公共卫生学院卫生检验教研室，太原　030001)



荧光法测定果蔬中叶酸含量的研究

王梦，张加玲

(山西医科大学公共卫生学院卫生检验教研室，太原030001)

摘要：目的：建立水果蔬菜中叶酸含量的荧光测定方法。方法：样品经NaOH提取后，在0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)反应介质中被KMnO4氧化，空白以1mol/L H2SO4作为反应介质进行氧化，在λ(ex)=280nm、λ(em)=445nm条件下测定。结果：叶酸浓度在6.0～90μg/L范围内与ΔIF呈线性关系，线性回归方程为ΔIF=778.24C+1.1，r=0.9998；方法精密度为1.49%；对猕猴桃、苹果、梨、菠菜中叶酸含量进行测定，精密度为2.65%～9.95%，加标回收率为86.0%～107.5%，相对标准偏差为2.52%～8.73%。结论：本方法提取过程简单、灵敏度高、结果的精密度和准确度高，可用于水果蔬菜中叶酸的测定。

关键词：叶酸；荧光法；水果蔬菜

叶酸(folic acid，VM，蝶酰谷氨酸)属于水溶性维生素，广泛存在于新鲜水果、蔬菜、动物肝脏及豆类等食品中。叶酸在人体中作为一碳单位，参与人体的许多生理活动，叶酸缺乏可导致生理功能低下及某些疾病，如巨幼红细胞贫血、智力退化、新生儿神经管畸形、骨质疏松等症状[1]的发生。贫血及骨质疏松患者、孕妇和老人应增加叶酸的摄入量。因此食物中叶酸的测定对指导人们日常饮食、预防疾病发生具有重要意义。

目前，叶酸检测的主要方法有微生物法、液相色谱法、荧光法等[2]。微生物法为叶酸检测的经典方法，该方法可检测样品的种类多，灵敏度较高，操作步骤、样品处理简便，不需提纯处理，但是检测周期长、重复性不是很好[3]。现在使用较广泛的液相色谱法，适用范围广、分离效果好、分析速度快、测定结果准确。已有将HPLC、UPLC与质谱/串联质谱技术联用，同时结合同位素稀释技术对食品和临床样品进行检测[4-8]，不仅增加其检测的准确度和灵敏度，还可对不同形态的叶酸进行测定。但其仪器设备要求高，且一般都通过固相萃取小柱富集、纯化，操作步骤较复杂。荧光法快速、灵敏、选择性好，仪器简单。由于叶酸本身荧光较弱，将其氧化后产物的荧光强度可增加7～8倍，提高了测定的灵敏度。目前对水果蔬菜中叶酸的检测，多是利用活性炭或高效液相色谱将叶酸分离后测定。本研究将采用直接碱性溶液提取、离心分离的方法，经KMnO4氧化后，用荧光法检测水果蔬菜中的叶酸含量。

1材料与方法

1.1主要仪器与试剂

RF-540型荧光光度计(日本岛津)；SC-2556型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；叶酸标准品(含量≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；100μg/mL叶酸储备液：准确称取10mg叶酸标准品，用几滴0.01mol/LNaOH溶解后，用蒸馏水定容至100mL，4℃避光冷藏，用时稀释成不同浓度；0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)：0.2mol/L HAc和0.2mol/L NaAc按1：1(v/v)混合；0.01mol/L NaOH；0.1mol/L和1mol/L H2SO4；0.01mol/L KMnO4；1%H2O2(v/v)。

1.2工作曲线

将叶酸储备液稀释成中间液，取不同体积，用蒸馏水均补至3mL，使叶酸最终浓度为6、9、10、20、30、40、60、90μg/L，然后加3mL HAc-NaAc和0.5mL KMnO4进行氧化，放置20min后，用H2O2将过量的KMnO4还原，使溶液呈无色，用蒸馏水定容至10mL。对应空白加入等量叶酸后，以2ml H2SO4作为反应介质，经过相同氧化后，在λex=280nm、λem=445nm的条件下测定叶酸氧化物和空白的荧光I和I0，ΔIF=I-I0。ΔIF与叶酸浓度在6.0～90μg/L范围内呈线性关系，线性回归方程为ΔIF=778.24C+1.1，r=0.999 8。

1.3样品提取与氧化

准确称取适量样品，研碎，加入0.01mol/L NaOH 20～30mL，水浴加热10min，放至室温后加入0.1mol/L H2SO4将NaOH完全中和，定容至100mL。离心10min(4 000r/min)，取上清液≤3mL，按1.2步骤加2mL KMnO4氧化测定。

2结果与讨论

2.1检测波长的选择

按1.2步骤氧化叶酸，对其氧化物分别进行荧光光谱和激发光谱扫描。从光谱图可知：叶酸氧化物的最大激发波长在280nm和360nm处，最大发射波长在445nm处。本试验选择280nm为激发波长；叶酸氧化物的荧光强度是同浓度叶酸的7～8倍，因此氧化后测定灵敏度可提高7～8倍。

2.2KMnO4用量对荧光强度的影响

取等量叶酸标准溶液，加入不同体积的KMnO4，放置20min后定容测定。结果见表1。

表1　KMnO4用量对叶酸氧化物荧光强度的影响

从表1可知，随着KMnO4用量的增加，荧光强度逐渐降低。因此需将过量KMnO4除去，以消除其影响。综合考虑后选用H2O2将多余的KMnO4还原。

2.3H2O2用量对荧光强度的影响

取7支10mL比色管，加入等量叶酸工作液和0.3mL 0.001mol/LKMnO4，放置20min后加入不同体积的10%H2O2，定容测定。从表2可知：随着H2O2用量的增加，荧光强度先升高后降低。H2O2加入量小于0.3mL时KMnO4为过量，随着KMnO4不断被还原，其影响也逐渐减小，所以荧光强度逐渐增大；H2O2加入量为0.3mL时荧光强度达到最大；H2O2加入量大于0.3mL时，即H2O2过量后荧光强度逐渐降低。因此，试验中H2O2不可过量，使溶液刚好呈无色即可。

表2　H2O2用量对叶酸氧化物荧光强度的影响

2.4反应介质的选择

附图　叶酸在不同pH反应介质中被氧化后的荧光强度

测定等量叶酸工作液在不同pH值的反应介质中被氧化后的荧光强度，结果见附图。可以看出，叶酸在不同pH的反应介质中被氧化，其产物的荧光强度有很大不同。叶酸在HCl、HAc中氧化，产物的荧光强度虽然很强，但两者pH变化会引起荧光强度很大变化，给样品测定时条件控制带来困难。因此选择HAc-NaAc(pH=4.76)缓冲液作为反应介质。

2.5HAc-NaAc缓冲液用量的选择

向5份等量叶酸工作液中加入不同量浓度为0.2mol/mL的HAc-NaAc(pH=4.76)缓冲液，经过相同氧化后在同一条件下测定，同时做空白。结果如表3。

表3　HAc-NaAc缓冲液用量对叶酸氧化产物荧光强度的影响

可以看出，随着缓冲液用量的增加荧光强度逐渐降低，加入1mL的缓冲液即可获得较高的荧光强度。但考虑到样品测定的需要，所以选择加入3mL的缓冲液。

2.6H2SO4用量的选择

分别测定在0.5、1.0、2.0、3.0mL H2SO4体系中叶酸被KMnO4氧化后的荧光强度，同时对应做空白，结果如表4。

表4　H2SO4 用量对叶酸氧化产物荧光强度的影响

从表4可以看出，加入1.0mL H2SO4就可以将叶酸氧化物的荧光破坏，考虑到测定需要，选择加入2.0mL H2SO4破坏氧化物的荧光，得到样品中基质的荧光强度。

2.7精密度的测定

2.7.1方法精密度按1.2步骤平行测定6份浓度为60μg/L的叶酸氧化物的荧光强度，其相对标准偏差为1.49%。

2.7.2样品精密度取不同样品提取液氧化，按1.2步骤测定荧光强度，测定结果如表5，相对标准偏差在2.65%～9.95%之间。

表5　样品精密度试验(n=6)

2.8加标回收试验

分别于提取前向样品中加入3个浓度的叶酸标准溶液，测定结果如表6，加标回收率在86.0%～107.5%之间，相对标准偏差在2.52%～8.73%之间。

表6　加标回收率试验(n=6)

3结论

叶酸在pH=4.76的HAc-NaAc缓冲液中其氧化产物有较强的荧光，利用这种方法对弥猴桃、苹果、梨、菠菜中叶酸含量进行测定，提取过程简单、结果的精密度和准确度均较好，可用于蔬菜水果中叶酸的定量测定。◇

参考文献

[1]刘泰然，李洁，等.柱后衍生-高效液相色谱法测定保健食品、强化食品和营养素补充剂中的叶酸[J].中国卫生检验杂志，2008，18(2)：268-269，294.

[2]石丹，贾云虹，等.叶酸检测方法的研究现状及发展趋势[J].中国乳品工业，2009，37(3)：42-45.

[3]郭丽琼，等.果蔬中叶酸分析方法研究的进展[J].食品工业科技，2012，10(33)：402-406，411.

[4]Owens JE，Holstege DM，et al.Quantitation of total folate in whole blood using LC-MS/MS[J].J Agric Food Chem，2005，53(19)：7390-7394.

[5]Pawlosky RJ，Flanagan VP，Doherty RF.mass spectrometric validated high-performance liquid chromatography procedure for the determination of folates in foods[J].J Agric Food Chem，2003，51(13)：3726-3730.

[6]Liu J，et al.Quantitative analysis of tissue folate using ultra high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Anal Biochem，2011，411(2)：210-217.

[7]De Brouwer V1，et al.Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)for the sensitive determination of folates in rice[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2010，878(3-4)：509-513.

[8]Jia Liu，Russell Pickford，et al.Quantitative analysis of tissue folate using ultra high-performance liquidchromatography tandem mass spectrometry[J].Analytical Biochemistry，2010，411(2011)：210-217.

(责任编辑李燕妮)

Determination of Folic Acid in Fruits and Vegetables by Fluorescence Method

WANG Meng，ZHANG Jia-ling

(DepartmentofSanitaryInspection，SchoolofPublicHealth，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China)

Abstract：ObjectiveA quantitative method was developed for the analysis of folic acid in fruits and vegetables.MethodAfter being extracted by NaOH solution，the supernatant was oxidated by KMnO4 in 0.2mol/L HAc-NaAc(pH=4.76)，and the blank was in 1mol/L H2SO(4 ).The detection wavelengths of excitation and emission for the oxid were 280nm and 445nm respectively.ResultThe linear regression equation was ΔIF=778.24C+1.1 covering the range from 6.0～90μg/L with a correlation coefficient of 0.999 8.The method precision was 1.49%.The recoveries of spiked samples were between 86.0%～107.5% with RSD(n=6)ranging from 2.52% to 8.73%.ConclusionThis method was simple，sensitive and precise，which could be used in the quantitative detection of folic acid in fruits and vegetables.

Keywords：folic acid；fluorescence method；fruit and vegetable

通讯作者：张加玲(1961—)，女，硕士，硕士生导师，教授，从事卫生检验教学科研工作。

作者简介：王梦(1989—)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品卫生检验。