测定土壤硝态氮的紫外分光光度法和镉柱还原法比较①

涂 成，黄 威，陈安磊，宋 歌，陈春兰，王 卫，谢小立

(1 中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，长沙 410125；2 中国科学院大学，北京 100049；3 中国科学院南京土壤研究所，南京 210008)



测定土壤硝态氮的紫外分光光度法和镉柱还原法比较①

涂 成1,2，黄 威1,2，陈安磊1*，宋 歌3，陈春兰1，王 卫1，谢小立1

(1 中国科学院亚热带农业生态研究所，亚热带农业生态过程重点实验室，长沙 410125；2 中国科学院大学，北京 100049；3 中国科学院南京土壤研究所，南京 210008)

摘 要：使用改进的紫外分光光度法(校正因素法)和基于镉柱还原的流动注射分析法(镉柱还原法)测定了中国10种不同类型土壤的含量，分析了两种方法的差异性及其适用性。统计分析表明，改进紫外分光光度法与镉柱还原法测定的结果具有极显著的相关性，测定样品的准确度介于89%～104%，具有可比性。在浓度适用上略有差异，对含量极低的土壤样品，采用镉柱还原法可提高精确度；对于含量高的土样选用紫外法可提高测定精确度，测定结果变异性低于镉柱还原法，且紫外法测定值都要高于镉柱还原法。从仪器操作及校准角度来看，紫外法测定操作过程简便，影响因子较少，对批量快速测定更为适用。

关键词：紫外分光光度法；镉柱还原法；流动注射分析仪；土壤硝态氮

1 材料与方法

1.1 供试土样

从中国 10 个地区采集了 10 种土壤样品，采样点概况及供试土壤的基本性质见表 1。土壤含量介于 1～100 mg/kg 之间。由于受样品保存时间、水分含量、温度高低等因素的影响，新鲜土壤不适合用作分析方法的比较研究材料，本实验统一使用风干过 60 目筛的土样进行测定。

1.2 仪器

紫外可见光分光光度计(UV2450)，光程为 1 cm的石英比色皿；流动注射分析仪(FIAstar 5000)。

1.3 测定方法

本文使用的测定方法为紫外分光光度法[8-9]和基于镉柱还原的流动注射法。

表1　采样点概况及供试土壤的基本理化性状Table 1 Descriptions of sampling sites and properties of the selected soils

1.3.1 紫外分光光度法(以下简称为紫外法)波长选择：Norman等[10]以及李酉开[11]都选用210 nm波长，在该波长工作范围为N 0.05～1.5 mg/L，极大多数无机盐类已无吸收，但本研究中变化范围比较大，宋歌等[13]的研究表明该情况下选用220 nm测定比较合适，该波长下灵敏度虽有所降低，但工作范围却扩展为N 0.1～3.0 mg/L。因此，本研究选用220 nm波长。

操作步骤：称取40.00 g土样于250 ml聚乙烯瓶中，加入100 ml 1 mol/L KCl溶液，置于往复振荡机中，(25±1)℃ 条件下以150 r/min速度振荡1 h，悬液静置3～5 min后，将上清液用慢速定量滤纸过滤于塑料瓶中待测。同时，向聚乙烯瓶中仅加入浸提液重复上述步骤作为空白，待测液应在当天测定完毕。加标回收实验中，在浸提前将适量的标液加入，然后加浸提液振荡提取，以后步骤相同。

测定浸提液在 220 nm 和 275 nm 处吸光度A220和 A275。按下式计算校正吸光度 A：

采用 Norman 等[10,12]的方法去除浸提液中的再测定处理后的溶液在 220 nm 和 275 nm处的吸光度，计算二者的比值，即为 f。本方法参照宋歌等[13]在 9 种不同类型土壤上测定得到的 2.2作为 f 值。建立 A 与 浓度之间的相关曲线后，就可算出浸提液中 浓度。本方法采用工作范围为 0.1～5.0 mg/L 和 0.005～0.8 mg/L两套定标标准。

1.3.2 基于镉柱还原的流动注射法(以下简称为镉柱还原法)仪器配置：NO2/NO3方法盒，540 nm 测量滤光片和 720 nm 参比滤光片，5000 3139 预装还原镉柱。

测定原理：包含亚硝酸盐/硝酸盐的样品与缓冲溶液混合后经过镉柱，样品中的硝酸根被镉还原剂还原为亚硝酸根，原有的和从硝酸根还原得到的亚硝酸根与酸性的氨基苯磺酰胺(磺胺)溶液生成偶氮化合物，与萘胺盐酸盐进一步反应形成红色含氮染料，在540 nm处进行测量。本方法所测试的氮为土壤浸出液中的硝酸盐和亚硝酸盐总和，但与硝酸盐量相比本研究样品中亚硝酸盐极低，可忽略不计。

操作步骤：样品前处理操作步骤同1.3.1，滤液上流动注射仪测定。为提高样品低浓度时的测定精度，本方法采用工作范围为0.1～5.0 mg/L 和 0.005～0.8 mg/L两套定标标准，样品圈分别为40 µl和400 µl。在样圈变换过程中同时进行时间校正，防止读数波峰延迟。

1.4 统计方法

使用 SAS8.1 对测定结果进行统计分析，其中不同方法测定结果的比较使用单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 方法的检出限和定量限比较

检出限是指产生一个能可靠地被检出的分析信号所需要的某元素的最低浓度或含量，而定量限是指样品中被测物能被定量测定的最低值。对两种方法的校准曲线进行统计，所有校准曲线线性拟合的判定系数均高于0.999 0。根据MacDougall等方法[14]和国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的规定，采用空白测量(不少于20次)平均值加3倍标准差作为方法的检出限，采用空白测量平均值加10倍标准差作为方法的定量限。本研究中采用工作范围为0.1～5.0 mg/L和0.005～0.8 mg/L两套定标标准。紫外分光光度法低标定标标准(0.005～0.8 mg/L)的检出限为0.24 mg/kg，定量限为0.55 mg/kg，而镉柱还原法的检出限为0.18 mg/kg，定量限为0.38 mg/kg；高标定标标准(0.1～5.0 mg/L)中紫外分光光度法的检出限为0.20 mg/kg，定量限的为0.44 mg/kg，而镉柱还原法的检出限为0.23 mg/kg，定量限为0.55 mg/kg。可见在低浓度时，镉柱还原法的精确度略高于紫外分光光度法，而高浓度测量时其精确度略低于紫外分光光度法。但镉柱还原法在定标标准改变时，需要调整流动注射仪的样品圈，如低浓度测定时，需要把样品圈分别从40 µl换成400 µl，测高浓度时再换成40 µl的样品圈，而紫外法可直接测定，不需要改变仪器配置。

2.2 测定均值比较

表2　两种方法土壤硝态氮的测定结果(mg/kg)Table 2 Comparison between the two methods indetermination

表2　两种方法土壤硝态氮的测定结果(mg/kg)Table 2 Comparison between the two methods indetermination

注：同列数据小写字母不同表示两种方法测定差异达到P＜0.05 显著水平。

方法 　　项目土样编号A 　B 　C 　D 　E 　F 　G 　H 　I 　J镉柱法　均值 　8.12 b 　4.33 b 　32.23 b　 5.14 b　 9.68 b 　3.18 b　 46.11 a　 0.01 b 　11.82 a　 0.51 a标准差 　0.20 　0.13 　1.36 　0.27 　0.21 　0.15 　1.61 　0.02 　0.71 　0.04紫外法CV(%)　2.5 　3.1 　4.2 　5.2 　2.2 　4.6 　3.5 　138.4 　6.0 　7.8均值 　10.13 a 　5.74 a 　33.96 a　 5.44 a　 10.66 a　 3.43 a　 46.93 a　 0.10 a 　12.22 a　 0.47 a标准差 　0.25 　0.13 　0.74 　0.19 　0.15 　0.04 　0.78 　0.04 　0.38 　0.04 CV(%)　2.5 　2.3 　2.3 　3.5 　1.4 　1.1 　1.7 　40.5 　3.1 　8.7

两种方法对每种土样都进行了12批次测定，结果表明两种方法的重现性较好，各自平行测定值差异不显著。从两种测定结果的变异系数来看，两种方法的精确度都较高，但在高含量测定时紫外法的精确度较高，以往研究也得到类似的结果[3,10-11]。

两种测定方法的结果有显著差异，但有机质含量对测定结果干扰在两种方法差异性比较上并不一致，如北京褐土(J)有机质含量较低，而沈阳的潮棕壤(G)和常熟的水稻土(I)有机质含量较高，但两种方法未出现显著性差异，而其余土壤的测定结果表现出紫外法与镉柱还原法有显著差异性(P＜0.05)。宋歌等[13]利用紫外法和镀铜镉还原-重氮化偶合比色法测得不同土壤的结果也出现了显著性差异(P＜0.05)，陕红等[15]研究也发现分析方法可显著影响土壤中的测定值。本研究表明，测定方法间存在显著差异的土样均为紫外法测定结果高于镉柱还原法，这与陕红等[15]利用3种土壤进行测定方法比较的结果是一致的。两种方法测定结果出现差异可能与紫外法f 值的取值大小有关。每一种土壤的校正因数f 值取决于测试时选用的波长和有机质的性质。宋歌等[13]研究表明，紫外法与镀铜镉还原-重氮化偶合比色法相比较时，f 值取值为2.2，比取值为2.0的测定结果差异更小，但仍有个别土壤出现差异。因此，f 取何值时能够尽可能使全部类型的土壤测定的结果更为可信，且与经典方法无差异，这值得我们进一步研究分析。

2.3 两种分析方法准确度比较

表4结果表明，镉柱还原法测得回收率的范围是91%～104%，紫外法测得的回收率范围是89%～97%(除样品H外)，两种方法的回收率都达到了技术标准的实验要求[16]。对于含量次低的样品J，镉柱还原法测定的精确度更高些(表2)，而回收试验也表明镉柱还原法测定的准确度高于紫外法，可见从准确度角度考虑，镉柱还原法更适合低含量的测定。刘建坤等[17]总结紫外分光光度法和镉柱还原法测水中时表明，紫外分光光度法的LLD(检出下限)远高于镉柱还原法，同样说明低浓度的测定适宜选用镉柱还原法。对于高含量的土样测定，无论是重复测定结果还是加标回收试验结果，都表现出紫外法的变异系数远小于镉柱还原法，说明前者对含量较高的样品(本研究中＞3 mg/kg)测定精确度更好。

表3　两种测定方法的硝态氮回收率(n = 6)Table 3 Recoveries of the two soil N-N determination methods

表3　两种测定方法的硝态氮回收率(n = 6)Table 3 Recoveries of the two soil N-N determination methods

方法 　　项目土样编号A 　B 　C 　D 　E 　F 　G 　H 　I 　J镉柱法 　　回收率(%)　96 　92 　94 　91 　104 　94 　96 　93 　92 　94 CV(%)　2.5 　3.1 　4.2 　5.2 　2.2 　4.6 　3.5 　140.7 　6.0 　7.5紫外法 　　回收率(%)　97 　94 　94 　91 　96 　96 　94 　84 　91 　89 CV(%)　2.5 　2.4 　2.2 　3.4 　1.4 　2.6 　1.5 　41.6 　3.1 　8.9

另外，镉柱还原法尽管使用了自动化的流动注射分析仪避免了人为操作误差，具有分析速度快、操作自动化等优点，但受镉柱还原率、时间校正等因子影响，在仪器校准等方面要求高于紫外法，可能会出现重复性和稳定性较差的现象。叶祥盛等[18]对镉柱还原法与酚二磺酸比色法比较发现镉柱还原法精密度不如酚二磺酸比色法，但两者准确度相同。

2.4 两种分析方法的相关性及适用性分析

镉柱还原法与紫外法测定结果的相关性分析表明，两种方法测定值之间极显著相关(y = 1.018x + 0.581 2，R2= 0.998，P＜0.01，n = 12)，因此这两种方法之间具有可比性。宋歌等[13]对4种方法测定的结果进行比较发现，紫外分光光度法与酚二磺酸比色法等3种经典方法完全可以进行对比。叶祥盛等[17]研究表明，基于镉柱还原的流动注射分析法与酚二磺酸比色法相关性极显著，两种方法测定的结果相差很小。这说明紫外法和镉柱还原法测定的结果是可信的。

从仪器操作和校准上，镉柱还原法较紫外法更为复杂，其耗材如镉柱等成本高，也易形成污染。紫外法测定所需要的仪器便宜，低浓度测定结果与镉柱还原法相比并没有显著差异，而高浓度测定时优势明显(精密度、稳定性及精确度较高)，操作简便，在自动进样装置配合下紫外法的适用范围可能更广。

3 结论

两种测试分析方法所测定的值有一定的差异，在如何消除测定值的差异性上，需要深入研究如何消除干扰因子、选择合理 f 值，继而减小两种方法的测定差异性，提高方法的适用性。

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Comparison Between Ultraviolet Spectrophotometry and Cadmium Reduction Method in Determination of Soil Nitrate-N

TU Cheng1,2,HUANG Wei1,2,CHEN Anlei1*,SONG Ge3,CHEN Chunlan1,WANG Wei1,XIE Xiaoli1
(1 Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region,Institute of Subtropical Agriculture,Chinese Academy of Sciences,Changsha 410125,China; 2 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3 Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210008,China)

Abstract:The modified UV spectrophotometry and cadmium reduction method(flow injection analysis)are two main methods applied to rapid analysis ofTo explore the difference and application in the measurement ofby the two methods,10 soil samples from different regions of China were determined by the two methods.Results showed that significant correlations existed betweencontents determined by the two methods,the precision of the two methods ranged from 89% to 104%.There are difference in methods application depend on the content range,for low content ofcadmium reduction method was better than UV spectrophotometry in accuracy,but for high content ofUV spectrophotometry was better with higher precision and lower variability,and the measured value using UV spectrophotometry method were higher than that using cadmium reduction method.UV spectrophotometry was more suitable for rapid analysis of large batches of soil samples for its simple operation and less interference factors.

Key words:UV spectrophotometry; Cadmium reduction method; Flow injection analysis;

作者简介：涂成(1990—)，女，湖北天门人，硕士研究生，主要从事农田环境研究。E-mail:1060033527@qq.com

* 通讯作者(alchen@isa.ac.cn)

基金项目：①国家自然科学基金项目(31200339)、湖南省科技计划项目(2014NK3083)和公益性行业(农业)科研专项(201203030)资助。

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.01.022

中图分类号：S151.9+5