洋河大曲中糖化酶高产霉菌的筛选鉴定及固态发酵条件优化

谢玉球，时　晓，周二干，苗秀珍，朱　超，葛向阳（.江苏洋河股份有限公司，江苏宿迁3800；.江南大学，江苏无锡4）



洋河大曲中糖化酶高产霉菌的筛选鉴定及固态发酵条件优化

谢玉球1，时晓1，周二干1，苗秀珍1，朱超1，葛向阳2
（1.江苏洋河股份有限公司，江苏宿迁223800；2.江南大学，江苏无锡214122）

摘要：从洋河酒厂中高温大曲中利用透明圈初筛得到5株霉菌，通过固态发酵测定酶活复筛的方法分离出1株产糖化酶且酶活性较高的霉菌菌株(编号YH-01)，根据其形态特征和ITS序列分析,该菌株为米曲霉(Aspergillus oryzae)。以该菌株为出发菌株，通过单因素试验和正交试验，优化固态发酵条件，测得糖化酶在料水比5∶3、装料量40 g/500 mL、发酵时间6 d时活力最高。

关键词：微生物；洋河大曲；糖化酶；筛选；鉴定；固态发酵

糖化酶是淀粉糖化酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3）的简称，又称为γ-淀粉酶（γ- amylase），因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。糖化酶能从淀粉非还原性末端依次切下一个葡萄糖单位，将淀粉水解成葡萄糖，因此，它广泛运用于酒精、白酒酿造、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、纺织、日化等生物工业中[1]。糖化酶是我国产量最大、应用最广的酶制剂之一。在传统的酿酒工艺中，采用的是自然接种，网罗自然界中的微生物[2]，不同微生物最佳生长和产酶条件不同，而制备强化大曲能够有效的提高原料利用率、降低生产成本、缩短生产周期等。本实验利用传统的分离方法和分子生物学相结合，筛选出糖化酶活性强的菌种，为葡萄糖生产或制备强化大曲应用于酿酒生产提供理论依据。

1　材料和方法

1.1材料、试剂与仪器

1.1.1材料

大曲样取自江苏洋河酒厂股份有限公司制曲厂房。

1.1.2主要药品与试剂

硫酸铜（CuSO4·5H2O），次甲基蓝，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，0.1 %标准葡萄糖溶液，2 %可溶性淀粉溶液，醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH4.6），1 mol/L氢氧化钠溶液，TE溶液，溶菌酶，SDS，蛋白酶K，饱和酚-氯仿，无水酒精，10×PCR缓冲液，dNTPs，Taq DNA聚合酶。

1.1.3仪器及设备

恒温振荡摇床，恒温培养箱，数字滴定器，离心机，显微镜，恒温振荡水浴锅，PCR扩增仪。

1.1.4培养基

分离培养基：可溶性淀粉0.5 g，硝酸钠3.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，氯化钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30.0 g，曲药浸汁(取曲药200 g，加入1000 mL水煮沸30 min，4层纱布过滤后抽滤至澄清)200 mL，琼脂20.0 g，蒸馏水800 mL，氯霉素105 U，去氧胆酸钠30.0 mg，pH6.0±0.2，0.1 MPa，121℃条件下灭菌20 min，冷却至约50℃，倒6～7块平板/100mL，冷却备用。

图1 初筛后各霉菌PDA平板菌落形态

PDA培养基：200 g土豆，洗净去皮切成小块，加水1000 mL，煮沸20 min,纱布过滤，滤液加水补足1000 mL，再加入20 g葡萄糖和20 g琼脂，在0.1 MPa，121℃条件下灭菌20 min。

固体发酵培养基：麸皮∶水=5∶3，搅拌均匀后取分装到500 mL三角瓶中，每瓶45 g/500 mL，在0.1 MPa，121℃条件下灭菌20 min。

1.2实验方法

1.2.1初筛

称取5 g大曲粉，放入盛有45 mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中。振摇10 min，振荡混匀后静置，吸取上清液1 mL加入9 mL无菌水试管中，依次进行梯度稀释，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的溶液，吸取各梯度溶液0.1 mL于分离培养基上涂布均匀，置于30℃培养箱中正置培养3～4 d。观察分离培养基平板长出的菌落周围有无透明水解圈，取水解圈较大者接种于PDA平板上划线分离至纯种，菌种试管斜面保存。

1.2.2复筛

初筛中选择水解圈较大的5株菌，进行复筛实验，取直径1 cm的各菌株霉菌琼脂小块放入霉菌固体培养基中摇晃均匀后，在30℃下培养3～7 d至长出孢子。

称取相当于5.0 g绝干曲的曲粉，放在250 mL三角瓶中，加水（90-5×水分%）mL，缓冲液10 mL，在30℃水浴中浸泡1 h，每隔15 min搅拌1次。然后用干滤纸过滤，弃去最初5 mL，接收50 mL澄清滤液备用得粗酶提取液后进行糖化酶活力的测定。酶活力越高，生产性能越好。

1.2.3高产糖化酶菌株的鉴定

菌株鉴定采用传统丝状真菌形态学特征与分子生物学相结合的方法，以菌落特征、颜色和显微形态为依据[3-5]，同时以研磨法提取的丝状真菌染色体DNA为模板，扩增待鉴定菌株的ITS序列，采用BLAST搜索程序，把实验中得到的实验信息与基因库中的基因序列进行比对，获得同源性分析结果。

1.2.4菌株生产性能的单因素及正交实验优化

分别从料水比、装料量、培养时间等因素通过单因素试验对菌株培养条件进行比较后，确定出产酶条件较好的因素水平，采用L9(34)表进行正交试验设计，以确定目标菌株的最佳培养条件。

2　结果与分析

2.1菌株筛选结果

从洋河大曲中选择水解圈较大的5株霉菌，图1为这5株霉菌在PDA平板上分离纯化后的菌落形态。经过复筛，测得酶活（见图2）。YH-01的糖化酶活性在3～6 d内为最高，在6 d时达到最高，为3683.34 U/g；其次是菌株2-005、0-002、0-001。

图2 各霉菌糖化酶活力曲线

2.2鉴定

菌株在PDA培养基上生长快，表面初期呈白色、黄色或淡黄绿色，后变黄褐色，菌丝呈黄绿色，显微镜下观察菌丝有隔膜、分生孢子梗下有足细胞。初步鉴定为曲霉。菌落如图1中YH-01，菌丝体、孢子囊见图3、图4。

通过16S rDNA基因序列分析，菌株测序鉴定blast比对结果见图5。YH-01菌株为米曲霉（Aspergillus oryza）。

2.3不同料水比对菌株产糖化酶的影响

选取酶活最高的菌株YH-01作为实验菌株。料水比设置为5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、5∶5，按上述料水比加水，料水混合均匀后，按照45 g/500 mL的装料量，分装到500 mL三角瓶中，0.01 MPa灭菌20 min，冷却后接种，接种量按1.2.2方法进行，置于30℃恒温培养箱中培养4 d，取样测定糖化酶活力，结果见表1。

图3 菌丝体

图4 分生孢子梗及孢子囊

图5 YH-01的测序鉴定blast比对结果

由表1可以看出，料水比在5∶3时，YH-01酶活最高，微生物的一切生化反应都离不开水，适宜的水分含量直接影响微生物对营养物质的利用效率，且米曲霉是好氧的微生物，当料水比低于5∶3，麸曲中心含有未被消耗的淀粉颗粒，料水比在5∶3时，麸皮湿润疏松，通气性好，观察发现菌丝均匀密集，曲呈棉絮状，不易摇散，当料水比高于5∶3时，原料发黏，透气性差，不利于菌丝的生长。资料表明[6]，营养菌丝是酶的主要来源，气生菌丝或分生孢子梗酶活很低或根本没有，因此，曲霉菌丝生长越旺盛，酶活相对就会高些。因此，采用5∶3的料水比做后续试验。

表1 不同料水比对YH-01产糖化酶的影响

2.4不同装料量对菌株产糖化酶的影响

按照料水比5∶3，分别以35 g/500 mL、45 g/500 mL、55 g/500 mL和65 g/500 mL、75 g/500 mL的装料量制备成固体培养基，接种后，30℃恒温培养4 d，取样测定糖化酶活力，结果见表2。

表2 不同装料量对YH-01产糖化酶的影响

由表2可以看出，随着装料量的增加，目的菌株酶活降低，在没用摇床培养的情况下，装料量越少，越有利于霉菌菌丝的大量生长，但是装料量太少，原料间距大，不利于菌丝的生成，且浪费试验用三角瓶数量，而装料量越多易造成菌丝生长不均匀，浪费原料，因此，选择装料量为45 g/500 mL。

2.5不同发酵时间对菌株产糖化酶的影响

料水比5∶3，装料量45 g/500 mL，灭菌冷却后接种，从第3天开始取样测定糖化酶活力，结果见表3。

表3 不同发酵时间对YH-01产糖化酶的影响

由表3可以看出，从第3天开始，YH-01菌株的糖化酶活力在3～6 d内随着培养时间的增加，糖化酶活力呈直线上升趋势，于第6天达到峰值3683.34 U/g干曲，之后随营养物质消耗和水分减少及孢子数增加，酶活力则快速下降。因此，YH-01菌株麸曲培养6 d酶活性最高。

2.6目标菌株生产性能的正交试验优化

通过单因素发酵产酶试验确定，在料水比5∶3、装料量45 g/500 mL、培养时间为6 d时，米曲霉所产糖化酶活性最大。因此，试验采取不同料水比、装料量、发酵时间3个因素，每一因素选择3个水平，以期获得最佳产酶条件，试验设计和结果见表4、表5。

表4 目标菌株产酶条件正交试验因素水平表

表5 目标菌株产酶条件正交试验结果

由表5可知，YH-01产糖化酶最佳工艺组合为：A2B1C2，即料水比为5∶3，装料量为40 g/500 mL，发酵时间6 d。3个因素对YH-01产糖化酶活强弱顺序依次为A＞B＞C，即料水比＞装料量＞发酵时间。

3　结论

从洋河大曲中分离出5株糖化力较高的菌株，其中酶活最高的菌株YH-01经过分子鉴定为米曲霉，以YH-01作为出发菌株进行固态发酵条件优化，该菌株在料水比5∶3、装料量40 g/500 mL、发酵时间6 d时酶活最高，糖化酶活力为3875.06 U/g干曲。将进一步对该菌株酶的形成条件以及其固体发酵产酶的温度、pH值、接种量、翻曲时间等进行条件优化，提高产酶率。因米曲霉具有较为丰富的酶系，拥有较高的蛋白酶活性，后续将研究不同曲料pH值、培养温度、培养时间对米曲霉产蛋白酶活力的影响，最终制备强化大曲应用于酿酒生产。

参考文献：

[1]武金霞,王沛,李晓明.糖化酶的研究进展及趋势[J].自然杂志, 2003,25(3)：161-163.

[2]肖冬光.白酒生产技术[M].北京：化学工业出版社,2005.

[3]陈声明,张立钦.微生物学研究技术[M].北京：科学出版社, 2006.

[4]乔宗伟,张文学.浓香型白酒糟醅微生物分离培养基的选择和研究[J].酿酒科技, 2004(6)：30-32.

[5] Lane D J, Pace B, Olsen G J, et al. Rapid determination of 16S ribosomal RNAsequences for phylogenetic analyses[J]. Proc Natl Acad Sci,1985,82：6955-6959.

[6]康明官.日本清酒技术[M].北京：轻工业出版社,1986：35-36.

Separation and Identification of Mold Strain with High-Yield of Glucoamylase from Yanghe Daqu and Optimization of Its Solid-State Fermentation Conditions

XIE Yuqiu1, SHI Xiao1, ZHOU Ergan1, MIAO Xiuzhen1, ZHU Chao1and GE Xiangyang2
(1.Yanghe Distillery Co.Ltd., Suqian, Jiangsu 223800; 2.Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122,China)

Abstract:Five mold strains were separated from Yanghe Daqu by transparent circle primary screening, then a strain YH-01 with high-yield of glucoamylase was separated from the five strains by measurement of enzyme activity after solid fermentation. According to its morphological characteristics and ITS sequence analysis, YH-01 was Aspergillus oryzae. Through single factor test and orthogonal tests, solid fermentation conditions of YH-01 were optimized and summed up as follows: the ratio of bran and water was 5∶3, loading capacity was 40 g/500 mL, and 6 d fermentation time. Under above conditions, the activity of glucoamylase was the highest.

Key words:microbe; Yanghe Daqu; glucoamylase; screening; identification; solid-state fermentation

通讯作者：苗秀珍，硕士，研究方向：工业微生物育种，E-mail：bilbobaggins@126.com。

作者简介：谢玉球(1957-)，男，江苏宿迁人，高级工程师，高级评酒师，国家白酒评委，现任江苏洋河酒厂股份有限公司总工艺师。

收稿日期：2016-02-02

DOI：10.13746/j.njkj.2016040

中图分类号：TS262.3；TQ925.7；Q93-3

文献标识码：A

文章编号：1001-9286(2016)04-0039-04

优先数字出版时间：2016-03-04；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.ts.20160304.1442.008.html。