荧光定量PCR技术在骨关节结核石蜡包埋标本检测中的应用价值

穆晶 赵丹 刘子臣 车南颖 张海青



·论著·

荧光定量PCR技术在骨关节结核石蜡包埋标本检测中的应用价值

穆晶 赵丹 刘子臣 车南颖 张海青

目的 探讨荧光定量聚合酶链式反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)在骨关节结核石蜡包埋标本病理诊断及鉴别诊断中的应用价值。方法 搜集2014年10月至2015年4月首都医科大学附属北京胸科医院病理科诊断形态学符合结核的93例患者的石蜡包埋标本， 12例骨肿瘤患者的石蜡包埋标本。所有标本以FQ-PCR技术检测结核分枝杆菌DNA，以抗酸染色法查找抗酸杆菌。以卡方检验分析实验数据，比较FQ-PCR技术与传统抗酸染色法在骨关节结核诊断中的敏感度和特异度；观察不同发病部位与两种技术检测阳性率之间的相关性；以PCR-反向点杂交法对7例结核分枝杆菌DNA阴性而抗酸染色阳性患者进行非结核分枝杆菌检测。结果 所有93例骨关节结核标本中FQ-PCR技术检测阳性77例，敏感度82.8%；抗酸染色查到抗酸杆菌64例，敏感度68.8%。FQ-PCR技术检测敏感度明显高于抗酸染色法(χ2=5.659，P=0.021)。在不同发病部位FQ-PCR技术敏感度均高于抗酸染色法：在脊柱病变FQ-PCR技术和抗酸染色法阳性率分别为84.0%(42/50)和64.0%(32/50)(χ2=0.009，P=0.609)；在外周骨关节病变FQ-PCR技术和抗酸染色法阳性率分别为81.4%(35/43)和74.4%(32/43)(χ2=12.609，P=0.002)。PCR-反向点杂交法检测确定戈登分枝杆菌1例。结论 FQ-PCR技术较抗酸染色法显著提高了结核分枝杆菌阳性检出率，并为进一步检测非结核分枝杆菌做出重要提示，FQ-PCR技术在骨关节结核石蜡包埋标本检测中具有良好的应用价值。

结核，分枝杆菌； 结核，骨关节； 聚合酶链式反应； 抗酸染色

骨关节结核是除淋巴结核和结核性胸膜炎外最常见的肺外结核，约占结核病患者的1%～3%[1]，是危害人们健康的严重感染性疾病。骨关节结核致残率非常高，严重影响人们的健康、工作和生活。在常规病理诊断中，要确诊结核病，除了要观察到以肉芽肿伴干酪样坏死为特征的病理组织学改变外，还需找到结核分枝杆菌作为病原学支持。抗酸染色法(acid-fast staining)寻找结核分枝杆菌是病理科最普遍、最常用的方法[2]，但该方法存在敏感度低、特异度差、费时费力等不足[3-4]。近年来，从石蜡组织中提取总DNA，应用FQ-PCR技术检测石蜡组织中结核分枝杆菌的特异基因，越来越受到重视。多项研究表明，该技术在肺结核组织及淋巴结结核石蜡包埋标本中的检测敏感度较常规抗酸染色有很大提高[5-6]，但在骨关节结核石蜡包埋标本中的检测效率的研究比较少。因此，本研究纳入了病理组织学形态符合结核的93例骨关节病变患者，应用荧光定量聚合酶链式反应(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)技术检测结核分枝杆菌DNA，探讨其在骨关节结核病理诊断及鉴别诊断中的意义。

资料和方法

一、 研究对象

搜集2014年10月至2015年4月首都医科大学附属北京胸科医院病理科连续送检的骨关节结核病灶清除组织，将病理组织形态为慢性肉芽肿性炎伴坏死(图1)，诊断为“结核”或“符合结核”的骨关节结核患者93例列为研究对象。其中男58例，女35例，年龄范围1～83岁，平均年龄(40.14±19.65)岁，其中1～岁8例(8.6%)，15～岁75例(80.6%)，≥65岁10例(10.8%)。根据病变发生部位不同，分为脊柱病变和外周骨关节病变，其中脊柱病变50例(53.8%)：腰椎24例(25.8%)、胸椎13例(14.0%)、胸腰椎6例(6.5%)、腰骶椎5例(5.4%)、颈胸椎2例(2.2%)；外周骨关节病变43例(46.2%)：膝关节8例(8.6%)、髋关节7例(7.5%)、足部(踝关节，跟骨)7例(7.5%)、肘关节5例(5.4%)、腕关节4例(4.3%)、肩关节3例(3.2%)、骶髂关节3例(3.2%)、指骨3例(3.2%)、胸壁2例(2.2%)、耻骨1例1.1%。选取同期骨肿瘤患者12例，其中浆细胞性骨髓瘤6例，骨巨细胞瘤3例，骨淋巴瘤3例。对93例患者石蜡包埋标本和12例骨肿瘤患者的标本进行FQ-PCR检测。

图1 脊柱病灶组织呈肉芽肿性炎伴坏死、死骨、出血 (HE ×200)

二、 实验方法

1. 标本处理：所有标本均经4%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋。

2. 抗酸染色：抗酸染色试剂盒(BA-4090B)购自珠海贝索生物技术有限公司。抗酸染色：石蜡切片厚4 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇(高浓度到低浓度)后入水；石碳酸复红染色1 h，水洗后盐酸乙醇分化数秒至无红色，再水洗；亚甲蓝染色20 s，水洗；梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，中性胶封片，油镜下观察。结果判定：观察见到红色杆状、略弯曲、串珠状抗酸杆菌为抗酸染色阳性(图2)。

图2 抗酸染色见红色杆状、略弯曲抗酸杆菌(油镜 ×1000)

3. FQ-PCR检测结核分枝杆菌：石蜡包埋组织标本的DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京)，DNA提取按照试剂盒操作手册进行。结核分枝杆菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法，Z-RD-0060-02)购自上海之江生物科技股份有限公司。实时荧光定量PCR仪为美国罗氏公司的Cobas Z 480。PCR扩增体系总体积40 μl：TB PCR反应液36 μl，Taq酶0.4 μl，模板4 μl。将处理过的标本、阳性和阴性质控品分别吸取4 μl加入配制好的PCR体系中。PCR反应参数：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min；再按93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循环40次，然后使用荧光定量PCR仪检测；荧光信号收集时设定为羧基荧光素(FAM)，荧光信号收集设置在60 ℃。按照试剂盒说明书分析结果，出现典型S形扩增曲线为阳性。

4. PCR-反向点杂交法检测非结核分枝杆菌：分枝杆菌菌种鉴定基因检测试剂盒(PCR-反向点杂交法，M20141001)购自亚能生物技术(深圳)有限公司。PCR扩增体系总体积25 μl：PCR反应管内(含反应液)加入待测样品4 μl，同时取2个PCR反应管，分别加入阳性质控品和阴性质控DNA。PCR反应参数：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；再按95 ℃ 45 s，68 ℃ 60 s，循环30次；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，循环30次；68 ℃10 min。依次杂交，洗膜，显色。根据膜条上探针位点进行结果判读。

三、 统计学分析

利用SPSS 21.0统计软件进行χ2检验分析，P<0.05差异具有统计学意义。

结 果

1. FQ-PCR法与抗酸染色法与临床特征的关系：本组患者中男58例，占62.4%，女35例，占37.6%； 15～岁患者占80.6%(75/93)；脊柱是骨关节结核的最高发部位，占53.8%(50/93)，其次为膝关节8.6%(8/93)。抗酸染色法及FQ-PCR检测结核分枝杆菌的敏感度在不同性别、年龄及不同病变部位组患者的差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表1)。

2. FQ-PCR法与抗酸染色法的比较分析：93例骨关节结核患者中，77例FQ-PCR法检测结核分枝杆菌特异基因序列呈阳性，敏感度82.8%；64例抗酸染色查到抗酸杆菌，敏感度68.8%，FQ-PCR法敏感度明显高于抗酸染色法(χ2=5.659，P=0.021)。12例骨肿瘤标本的FQ-PCR检测和抗酸染色均为阴性，FQ-PCR技术特异度和抗酸染色法的特异度均为12/12。

3. FQ-PCR法与抗酸染色法在不同病变部位敏感度比较：50例脊柱病变中32例抗酸染色阳性，阳性率64.0%；42例FQ-PCR检测呈阳性，阳性率84.0%。43例外周骨关节患者中32例查到抗酸杆菌，阳性率74.4%；35例FQ-PCR检测阳性，阳性率81.4%。FQ-PCR在脊柱标本和外周骨关节标本的阳性检出率均高于抗酸染色法，并且在外周骨关节标本中FQ-PCR技术阳性率与抗酸染色法比较差异有统计学意义(χ2=12.609，P=0.002)(表1)。

表1 不同性别、年龄和病变部位骨关节结核患者标本的抗酸染色法和FQ-PCR检测敏感度比较

注a,b,c：抗酸染色法在不同性别、年龄和不同病变部位的敏感度比较；d,e,f：FQ-PCR技术在不同性别、年龄和不同病变部位的敏感度比较；g：抗酸染色法与FQ-PCR技术在脊柱结核中敏感度比较；h：抗酸染色法与FQ-PCR技术在外周骨关节结核中敏感度比较；i：抗酸染色法与FQ-PCR技术在所有骨关节结核中敏感度的比较

4. PCR-反向点杂交法检测非结核分枝杆菌：对7例结核分枝杆菌DNA阴性而抗酸染色查到抗酸杆菌的患者进行非结核分枝杆菌菌种鉴定，检测出戈登分枝杆菌感染1例。

讨 论

传统病理学诊断是通过大体和镜下观察病灶组织的病理形态学改变来获得诊断结果。结核病具有特殊的病理学形态特点，如肉芽肿结构，包括类上皮细胞、朗格汉斯巨细胞(Langhans giant cell)，以及干酪样坏死等，可与大多数其他感染性疾病及慢性炎症进行鉴别诊断[7]。此外，在标本中找到抗酸杆菌也是结核病病理学诊断的重要依据。骨关节结核的诊断也是如此。随着基因检测技术的发展，分子生物学检测技术也逐渐应用于病理学诊断中。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是通过特异扩增目标基因片段而获得结果，具有敏感度高、可鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌病(non tuberculous mycobacteria，NTM)等优势，临床多用于检测痰液、血液、尿液、脑脊液和胸腔积液等液态标本中的结核分枝杆菌DNA[8]。近年来，FQ-PCR技术也逐渐应用于组织标本中结核分枝杆菌DNA的检测。罗春英等[9]对174例肺、淋巴结、胸腹膜、肝、肾等部位具有肉芽肿性病变的石蜡包埋标本进行抗酸染色和结核分枝杆菌核酸荧光PCR检测，发现结核分枝杆菌核酸荧光PCR法阳性率明显高于抗酸染色法(30.5%，14.0%，P<0.05)。王旭洲等[10]比较了肺、淋巴结、皮肤等200例肉芽肿病变的FQ-PCR技术与传统抗酸染色及金胺O染色方法在组织标本中的结核病阳性检出率，发现PCR方法的阳性率明显高于抗酸染色和金胺O染色的阳性率(51.5%、31.0%、40.5%，P<0.05)。而PCR技术在骨关节结核石蜡组织标本中的应用情况，国内外罕有报道。

本研究纳入了我院骨科连续送检、临床诊断骨及关节结核、病理组织形态学具备肉芽肿性炎和坏死的骨关节病变93例，对其临床特征观察发现：93例骨关节结核患者80.6%在15～岁组，发病年龄仍以中青年人群为主[11-12]；男性感染者多于女性；脊柱为骨关节结核的最多发部位，占所有骨关节结核的1/2以上(53.8%)，其中又以腰椎最为多见，与文献报道一致[12-13]。

本研究结果显示，骨关节结核石蜡标本进行结核分枝杆菌FQ-PCR检测较抗酸染色法有明显优势。FQ-PCR技术的敏感度明显高于抗酸染色法(82.8%、68.8%；χ2=5.659，P=0.021)，FQ-PCR法与抗酸染色法相比提高了阳性检出率，在脊柱结核中提高20个百分点，在外周骨关节结核中提高了7个百分点。在所有93例患者中，两种方法均为阳性者57例，占61.3%；其中有3例抗酸染色仅查到1株抗酸杆菌，表明两种方法有较高的一致性；且当结核分枝杆菌菌量少，传统显微镜下查找较困难时，FQ-PCR技术由于具有较高的敏感度，仍可检测出结核分枝杆菌。此外，本研究中有20例FQ-PCR阳性患者，其抗酸染色为阴性，对照患者手术同时送检至我院结核病参比实验室的病灶脓液标本利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF)检测结果：12例为阳性，证实为结核分枝杆菌感染；2例未送检；8例阴性。进一步核查8例Xpert检测阴性患者的临床治疗情况，均对抗结核药物治疗反应良好。表明FQ-PCR检测技术在骨关节结核的诊断中具有较高的敏感度。

NTM是分枝杆菌属内除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌。NTM除侵犯人体肺脏、淋巴结、皮肤和软组织外，对骨骼、关节等组织器官也可致病[14]。NTM与结核分枝杆菌的菌体成分和抗原有其共同性，依靠病理组织形态和抗酸染色与结核病很难鉴别。本研究中有7例抗酸染色阳性患者，FQ-PCR检测结果为阴性。笔者以PCR-反向点杂交法对7例标本进行分枝杆菌菌种鉴定，检测出1例戈登分枝杆菌感染。对照患者手术同时脓液标本的Xpert检测结果，发现除戈登分枝杆菌感染患者的Xpert结果为阴性外，其余6例Xpert结果为阳性，证实为结核分枝杆菌感染。此例NTM的发现，不仅为临床治疗提供了重要依据，也是对传统结核病病理诊断新的挑战。

病理组织形态仍是结核病诊断的金标准，在组织形态学符合结核病诊断的基础上进行抗酸染色，为结核病的诊断提供病原学依据。而进一步以FQ-PCR技术检测结核分枝杆菌特异基因序列是非常有必要的：一方面弥补了抗酸染色由于人为主观因素造成的假阴性判断，提高了结核分枝杆菌的检出率；另一方面为是否进行非结核分枝杆菌检测提供了重要提示，有助于区别非结核分枝杆菌感染造成的假阳性诊断。

综上所述， FQ-PCR技术在骨关节结核石蜡包埋标本的病理学诊断和鉴别诊断中具有很好的应用价值。

志谢 感谢北京市结核病胸部肿瘤研究所流行病学研究室康万里同志在本研究实验数据分析及统计工作中给予的指导和帮助！

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(本文编辑：范永德)

Application value of fluorescence quantitative PCR technology in detection of paraffin-embedded specimens from bone and joint tuberculosis

MUJing,ZHAODan,LIUZi-chen,CHENan-ying,ZHANGHai-qing.

DepartmentofPathology,BeijingChestHospital，CapitalMedicalUniversity；BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

ZHANGHai-qing,Email:zhqing56@sina.com

Objective To explore the value of fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) technique in the diagnosis and differential diagnosis of paraffin-embedded specimens from bone and joint tuberculosis (BJTB). Methods Ninety three BJTB specimens and 12 specimens of bone neoplasm were collected during October 2014 to April 2015 in Beijing Chest Hospital, Capital Medical University. Comparison of FQ-PCR technique and conventional acid-fast staining technique in the diagnosis of tuberculosis in sensitivity and specificity by chi square test. To observe the correlation between the different sits and two detection positive rate, and the non tuberculosis mycobacterium was check out by PCR reverse dot blot hybridization in 7 specimens which had negative mycobacterium DNA and acid-fast staining positive. Results BJTB tissues in FQ-PCR detection ofMycobacteriumtuberculosiswere positive in 77 patients, positive rate of 82.8%; 64 cases were acid fast staining positive, positive rate of 68.8%. The sensitivity of FQ-PCR method was significantly higher than that of acid-fast staining (χ2=5.659，P=0.021). In different on set location FQ-PCR sensitivity were higher than that of acid fast staining: in the spine, FQ-PCR technique and acid fast staining positive rate was 84.0% (42/50) and 64.0% (32/50) (χ2=0.009，P=0.609) respectively; in the peripheral BJTB, FQ-PCR and acid fast staining positive rate were 81.4% (35/43) and 74.4% (32/43) (χ2=12.609，P=0.002) respectively.A strain of mycobacterium Gordon was checked out by PCR-reverse dot blot hybridization. Conclusion FQ-PCR technique improved the positive detection rate ofMycobacteriumtuberculosissignificantly compared to acid-fast staining and provide important tips for testing non tuberculosis mycobacterium. The FQ-PCR technology has good application value in the detection of paraffin-embedded specimens from BJTB.

Mycobacteriatuberculosis; Tuberculosis, Bone and Joint; Polymerase chain reaction; Acid-fast staining

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.04.009

首都卫生发展科研专项基金(2014-4-2161)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所病理科

张海青，Email：zhqing56@sina.com

2016-01-12)