泽兰乙醇提取物对糖尿病小鼠血糖及肝糖原含量的影响

崔书源，崔昊震，张默函(延边大学医学院，吉林延吉3300；延边大学中医学院)



泽兰乙醇提取物对糖尿病小鼠血糖及肝糖原含量的影响

崔书源1，崔昊震2，张默函1(1延边大学医学院，吉林延吉133002；2延边大学中医学院)

摘要：目的观察中药泽兰对糖尿病小鼠血糖及肝糖原含量的影响，并探讨磷脂蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)/糖原合成酶(GS)通路在其中的作用机制。方法选择40只小鼠，其中10只作为正常对照组，其余30只通过腹腔注射链脲佐菌素溶液制备糖尿病模型后，随机分为模型组、高剂量组和低剂量组各10只。制备泽兰乙醇提取物，高剂量组、低剂量组分别予泽兰乙醇提取物5.0、1.25 g/(kg·d)灌胃，正常对照组、模型组分别予蒸馏水10 mL/kg(kg·d)灌胃，共持续5周。尾静脉取血检测各组血糖水平。取血后脱颈处死各组小鼠，取肝脏组织，行碘酸雪夫染色检测肝糖原含量，高倍镜下测定每个视野糖原颗粒面积所占百分比。采用Western blot法检测各组肝组织中磷酸化AKT(p-Akt)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)、GS蛋白的表达。结果高剂量组、低剂量组给药后血糖水平均低于给药前(P<0.01或0.05)。模型组肝糖原面积百分比、p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表达均低于其他各组(P均<0.01)，低剂量组肝糖原面积百分比、p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表达均低于高剂量组(P均<0.05)。结论泽兰乙醇提取物可提高糖尿病小鼠肝糖原含量、降低血糖水平，其机制可能与上调AKT/GSK-3β/GS通路蛋白表达有关。

关键词：泽兰；糖尿病；肝糖原;磷脂蛋白激酶B；糖原合成酶激酶3β；糖原合成酶

泽兰是一种常见中草药，具有活血化瘀、行水消肿的作用，常用于糖尿病的治疗[1]。肝糖原是体内糖的储存形式之一，对于血糖水平的调节具有重要作用[2]。糖原合成酶(GS)是肝脏合成糖原过程的限速酶。磷脂蛋白激酶B(AKT)/糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)通路具有调控细胞糖原代谢的功能，其机制可能与调节GS的磷酸化有关[3]。2014年1月～2015年6月，我们观察了泽兰乙醇提取物对糖尿病小鼠肝脏肝糖原含量及AKT/GSK-3β/GS通路蛋白的影响，探讨泽兰乙醇提取物降糖作用的分子生物学机制，为糖尿病的中药治疗提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物与试剂成年雄性昆明小鼠40只，8周龄，体质量23～25 g，由延边大学实验动物中心提供，合格证号SCXK(吉)2011-0007。泽兰购自北京同仁堂。链脲佐菌素(STZ,Sigma)；兔抗小鼠p-AKT多克隆抗体(p-AKTSer473)；兔抗小鼠p-GSK-3β多克隆抗体(p-GSK-3βSer9)；兔抗小鼠GS多克隆抗体；兔抗小鼠多克隆β-actin抗体；辣根过氧化物标记IgG抗体。

1.2泽兰乙醇提取物的制备[4]泽兰干燥后切碎(1 cm左右)，在8倍95%乙醇中浸泡(≥12 h)，再分别用6倍、5倍95%乙醇回流提取，各次时间分别为2、1.5、1 h。合并过滤提取液，浓缩至浸膏，保存备用。

1.3动物分组及模型制备选择10只小鼠作为正常对照组，其余30只通过腹腔注射STZ溶液制备糖尿病模型后，随机分为模型组、高剂量组和低剂量组各10只。模型制备方法：适应性喂养1周后，禁食但不禁饮水24 h，按0.12 mg/g腹腔注射STZ溶液(浓度为20 mg/mL)。常规喂养60 h后，禁食但不禁水12 h。尾静脉取血，检测空腹血糖(FPG)，以FPG≥11.1 mmol/L为糖尿病模型制备成功。

1.4干预方法高剂量组、低剂量组分别予泽兰乙醇提取物5.0、1.25 g/(kg·d)灌胃，正常对照组、模型组分别予蒸馏水10 mL/kg(kg·d)灌胃，均为1次/d，共持续5周。实验期间均普通饲料喂养，自由进食饮水。

1.5血糖水平检测灌胃5周后，尾静脉取血检测各组小鼠血糖水平。

1.6肝糖原含量检测各组小鼠尾静脉取血后脱颈处死，迅速剖腹取肝脏，投入4 ℃ Carnoy液中固定12 h后，脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，切片。然后脱蜡水化，行碘酸雪夫染色显示肝糖原[3]。光镜下肝糖原呈紫红色颗粒。染色后利用病理显微分析系统进行定量分析，在×200高倍镜下测定每个视野糖原颗粒面积所占百分比。

1.7PI3K/AKT/GSK-3β通路蛋白表达检测采用Western blot法。取部分肝脏组织，按照小量组织蛋白提取试剂盒要求提取总蛋白，全波长分光光度计测定蛋白样品浓度。取待测蛋白煮沸2 min，加样40 μg/孔。10%SDS-PAGE电泳分离后，利用半干转移法将分离胶内的蛋白转移到PVDF膜。用5%脱脂奶粉TBS-T缓冲液封闭PVDF膜上的非特异性位点，分别加入兔抗小鼠p-AKT多克隆一抗(1∶400)、兔抗小鼠p-GSK-3β多克隆一抗(1∶500)、兔抗小鼠GS多克隆一抗(1∶500)，4 ℃过夜，洗涤后加入辣根酶标记山羊抗兔IgG(1∶1 000)，与膜室温下孵育1 h，洗膜。图像分析系统曝光成像并分析图像，以β-actin为参考，计算p-AKT、p-GSK-3β、GS蛋白的相对表达量。

2结果

2.1各组给药前后血糖水平比较高剂量组、低剂量组给药后血糖水平均低于给药前(P<0.01或0.05)。正常对照组与模型组给药前后血糖水平差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　各组给药前后血糖水平比较

注：与同组给药前比较，*P<0.01，﹟P<0.05。

2.2各组肝糖原含量比较正常对照组、模型组、高剂量组、低剂量组肝糖原面积百分比分别为42.58%±0.79%、17.46%±0.92%、39.71%±0.68%、26.16%±0.19%，模型组低于其他各组(P均<0.01)，低剂量组低于高剂量组及正常对照组(P均<0.05)。

2.3肝组织p-AKT、p-GSK-3β与GS蛋白表达比较模型组p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表达均低于其他三组(P均<0.01)，低剂量组p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表达均低于高剂量组及正常对照组(P均<0.05)。见表2、图1。

表2　　　　各组肝组织p-AKT、p-GSK-3β

注： 与模型组比较，*P<0.01；与低剂量组比较，#P<0.05。

图1　　　　各组肝组织p-AKT、p-GSK-3β

3讨论

糖尿病是一种由于胰岛的功能减退和(或)机体的胰岛素抵抗，而引发的机体内蛋白质、糖、脂肪等物质代谢紊乱性疾病[5]。对血糖水平的调控是防治糖尿病及其并发症的关键，血糖水平调控不佳可能引发肾、眼、消化道、足、神经等部位病变，严重影响生活质量[6]。

中草药已被用于糖尿病的治疗，在发挥降糖作用的同时可改善机体的功能，且有治疗靶点多、作用机制多向性等特点[7]。泽兰为双子叶植物药唇形科植物地瓜苗的茎叶，具有活血化瘀、行水消肿及调节机体新陈代谢的功效[8,9]。因此，在中药治疗糖尿病过程中，泽兰常被作为大方剂的重要组成部分，但单独研究泽兰降糖作用及机制的研究较少。本研究发现，给予泽兰乙醇提取物灌胃后，高剂量组及低剂量组血糖水平均降低，提示泽兰乙醇提取物能够降低糖尿病小鼠的血糖水平，具有降糖作用。

肝糖原贮藏于肝细胞质中，是机体糖类储存的主要形式之一，其含量的变化可影响血糖水平[10]。肝糖原的合成是有多种酶参加的复杂过程。正常状态下，肝脏中的葡萄糖在己糖激酶和ATP的作用下先被磷酸化成6-磷酸葡萄糖，再经1-磷酸葡萄糖而成UDP葡萄糖，在糖原合成酶的作用下生成糖原。GS是肝脏合成糖原过程的限速酶，其活性受变构和共价修饰的调节[11]。GSK-3β是一种多功能的可激活丝氨酸/苏氨酸类蛋白的激酶，广泛存在于真核生物细胞中，参与细胞分化、增殖、胚胎发育、细胞凋亡等多种生物学功能行为，并可磷酸化GS使其失活，参与抑制肝糖原合成过程[12]。GSK-3β是AKT的下游效应物，磷酸化后AKT被活化，进而磷酸化GSK-3β[13]。磷酸化的GSK-3β不具有生物学活性，即磷酸化的GSK-3β不能够磷酸化GS，而保持GS在糖原合成中的作用[14]。糖尿病状态下，由于高糖的作用，使得肝细胞中的活性氧(ROS)和糖基化终产物增加，抑制AKT上游PI3K的表达，进而抑制了AKT的磷酸化，减少了GSK-3β的磷酸化，从而增加了GSK-3β的活性，抑制GS的活性[15]。本研究发现，模型组肝糖原含量、p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表达均低于其他各组，提示糖尿病小鼠肝糖原含量降低，肝糖原含量降低可能与p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表达下调有关，而低剂量、高剂量的泽兰乙醇提取物均可提高糖尿病小鼠肝糖原含量，考虑泽兰乙醇提取物可能通过上调AKT/GSK-3β/GS通路发挥提高肝糖原含量的作用，其机制可能为通过促进AKT的磷酸化，继而磷酸化GSK-3β，使GSK-3β失活而减少了GS的磷酸化，增加了GS的相对含量，从而提高了肝糖原含量。本研究同时发现，高剂量组肝组织肝糖原含量、p-AKT、p-GSK-3β及GS蛋白表达均高于低剂量组，提示泽兰乙醇提取物提高肝糖原含量及上调AKT/GSK-3β/GS通路的作用与其剂量有关，高剂量应用时的作用更明显，表明可能具有一定的量效关系。

综上所述，泽兰乙醇提取物可提高糖尿病小鼠肝糖原含量、降低血糖水平，其机制可能与上调AKT/GSK-3β/GS通路蛋白表达有关。

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(收稿日期：2015-11-04)

中图分类号：R587.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)14-0036-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.012

通信作者：张默函(E-mail: 809118439@qq.com)