基于质谱技术的磷酸化蛋白/多肽分离富集、鉴定及组学研究

龙星宇,　练鸿振

(生命分析化学国家重点实验室, 南京大学化学化工学院, 南京大学现代分析中心, 江苏 南京 210023)



聚焦

基于质谱技术的磷酸化蛋白/多肽分离富集、鉴定及组学研究

龙星宇,练鸿振*

(生命分析化学国家重点实验室, 南京大学化学化工学院, 南京大学现代分析中心, 江苏 南京 210023)

蛋白质的磷酸化是生物体内一种广泛的、重要的翻译后修饰形式,调控着细胞信号传导、基因表达、分子识别、新陈代谢等细胞过程。在生物体液或组织中,许多低丰度的磷酸化蛋白/多肽是具有高度特异性的生物临床标志物,这些生物分子可能为许多疾病的诊断和病理研究提供重要信息,因此对其进行分析具有重要意义。近些年该研究热点备受广大分析工作者的青睐[1,2]。本文基于2016年1～2月主流期刊最新录用和在线发表的基于质谱技术的磷酸化蛋白/多肽相关论文,从生物分离和富集、磷酸化位点识别和鉴定及组学研究等方面,讨论该研究领域的最新动态和进展。

1磷酸化蛋白/多肽的分离和富集研究

质谱是磷酸化蛋白/多肽分析最为常用的工具,但磷酸化肽天然丰度低、离子化效率低且易受其他非磷酸化肽段的干扰,使得其选择性富集成为质谱分析前的必要步骤。从2015年发表的专门涉及新型亲和材料对磷酸化肽富集的文献综述[3]来看,设计和发展新型纳米结构功能材料作为固相萃取基质或功能载体,实现对磷酸化肽有效富集,仍然是目前该领域的主要发展方向之一。

Liu课题组[4]按照他们自己新构建的双模板对接导向分子印迹(dual-template docking oriented molecular imprinting, DTD-OMI)策略,制备出磷酸盐印迹的介孔硅纳米材料(mesoporous silica nanoparticles, MSNs),并构建离线平台,成功地应用于β-酪蛋白、脱脂牛奶中的磷酸化肽富集,用于MALDI-TOF MS分析。材料制备主要包括以下3个步骤:(1)双模板化合物的形成,即磷酸盐(印迹模板)通过静电吸引连接杆状的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)胶粒(介孔模板); (2)导向模板,引入四乙氧基硅烷(TEOS)和脲丙基三乙氧基硅烷(UPTES)混合物作为合适的Si源前驱体,形成介孔硅纳米材料;(3)模板移除,即介孔模板和印迹模板的移除。该材料展现出对磷酸化肽优异的选择性、抗干扰强、吸附平衡快速、吸附容量大等特点,可以作为选择性富集磷酸化肽的理想吸附剂,还可以应用于其他生物样品中蛋白磷酸化分析。

阳离子交换色谱(AEX)是一种基于色谱技术富集磷酸化肽的有效方法,但相对于固定金属离子亲和色谱(IMAC)和金属氧化物亲和色谱(MOAC),探究AEX柱材料应用于磷酸化肽高特异性富集的研究较少。Feng课题组[5]成功制备了磁性的石墨氮化碳(magnetic graphitic carbon nitride(g-C3N4), MCN)材料,并将其引入AEX技术,应用于磷酸化肽富集。由于材料表面富含N,能维持其基本性能以及具有丰富的结合位点,在pH低至1.8时,磷酸化肽仍表现出优异的保留行为。得益于在如此低的pH条件下强的结合力,MCN材料展现出卓越的选择性,能够从标准蛋白混合物和脱脂牛奶的胰酶解液、人体血清中特异性捕获磷酸化肽。他们还将MCN材料应用于从鼠脑裂解液中选择性富集磷酸化肽,并且成功地鉴定了2 576条独特的磷酸化肽。此外,这种MCN材料还有可能应用于催化、传感等领域。

Krenkova等[6]基于钛氧化物或锆氧化物的无机纳米纤维材料(inorganic nanofibrous),从两种酪蛋白(α-/β-)酶解液中,选择性地高效富集磷酸化肽并通过MALDI/MS分析检测。他们采用扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射仪(XRD)和比表面积测定技术，对用高速离心纺丝技术(force-spinning)制备的ZrO2纳米纤维、商品化的锐钛矿型和金红石相TiO2材料进行了表征。在相同的容量条件下,所制备的纳米纤维状材料相比普通的球形材料,磁导率增加近两个数量级,展现出更高的磁导率,而且其渗透性大大增强。这些材料不仅可以对样品进行成批处理,而且还可以用作装柱填料;与传统装柱材料相比,无需高压就可以用来填充移液管吸头尖端。该纳米纤维材料还可以通过装柱内嵌入HPLC自动化系统,用于复杂生物类样品,如细胞裂解液的分析,具有广阔的应用前景。

Piovesana等[7]以硫酸亚铁铵和硫酸铁作为Fe2+/Fe3+源,通过共沉淀法制备出Fe3O4磁球,在外包覆一层聚多巴胺(PDA),再将Ti4+固定到PDA包裹的磁球表面,得到的Fe3O4@PDA-Ti4+可用于磷酸化肽的磁固相萃取及nanoHPLC-MS/MS分析,通过优化上样与洗脱条件,提高磷酸化肽的回收率和富集选择性,该操作与典型的鸟枪法蛋白质组学工作流程相兼容。同时,他们还考察了未固定Ti4+的Fe3O4@PDA材料对模拟样液(酪蛋白∶牛血清白蛋白, 1∶100)中磷酸化肽富集的对照实验,根据肽段的平均亲水性(grand average of hydropathy, GRAVY),离析的大多数是亲水肽。研究结果表明,PDA能够减少非特异性结合,并优先与亲水肽结合,是极性翻译后修饰的一个理想支持底物,可以应用于实际复杂样品中磷酸化肽分析。

蛋白质的糖基化也是蛋白质的一个非常重要的修饰过程,用于调节蛋白质的功能。但大多数研究者都只是单独地研究糖基化或磷酸化蛋白质的富集,没有建立对二者同时选择性富集的方法。Wang等[8]以聚丙烯腈(polyacrylonitrile, PAN)为前体,温和地合成了聚偕胺肟(polyamidoxime, co-PAN),该材料具有固定的亲水骨架和活性长链结构,能够成功地应用于糖肽的选择性富集;他们进一步将Ti4+固定到co-PAN微球表面得到co-PAN@Ti4+材料,有效地富集了磷酸化肽,并通过标准肽混合物和人体血清样评估了该聚合物材料的性能,实现了对糖肽和磷酸化肽有顺序的、选择性的高效富集。材料重复使用5次后,依旧保持很好的富集效率(>70%),这一聚合物材料对蛋白质组学研究具有潜在的应用价值。

2蛋白磷酸化位点鉴定

蛋白质磷酸化和去磷酸化是一个可逆过程,对蛋白质磷酸化位点鉴定和定量分析,有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。

Mansuri等[9]通过对原生生物痢疾变形虫的吞噬作用研究,证实了该吞噬作用与一种非典型的蛋白激酶EhAK1有关,具体是EhAK1与EhCaBP1相互作用被招募至吞噬杯的过程。进一步研究表明,EhAK1通过多重机制包括G-肌动蛋白磷酸化作用来控制肌动蛋白动力学。生化分析结果揭示,EhAK1是一种广谱的离子特异性丝氨酸/苏氨酸激酶,能够经历多重反式自身磷酸化反应酶解成多肽,无需其他底物。将EhAK1直接与三磷酸腺苷(ATP)在磷酸盐缓冲液中孵育,经过质谱分析,鉴定出了3个自身磷酸化位点(Ser 54、Ser 398和Thr 279)。

Ollikainen等[10]建立了一种微芯片电泳(microchip electrophoresis, MCE)方法,通过芯片上的电喷雾离子化(ESI)技术将样品引入质谱,实现对磷酸化肽的同分异构体的在线快速分离分析。而且,该方法可以在1 min内把相同氨基序列、不同位置异构的两条单磷酸化肽(IR1A, TRDIpYETDYYRK和IR1B, TRDIYETDpYYRK)和一条三磷酸化肽(IR3 TRDIpYETDpYpYRK)从胰岛素受体的其他非磷酸化肽中分离出来。在分析前,进一步对单磷酸化肽(IR1A和IR1B)进行芴甲基试剂(氯甲酸酯(Fomoc-Cl)或N-琥珀酰亚胺碳酸酯(Fomoc-OSu))衍生化处理,可以实现对IR1A和IR1B的分离,进而提高分离效率。研究结果表明,衍生化处理不仅可以提高单磷酸化肽的位置异构的分离效率,还可以通过二级质谱(MS/MS)来对磷酸化位点进行鉴定。

3磷酸化蛋白/多肽的组学研究

对标准磷酸化蛋白或单一蛋白质进行研究,远远不能满足蛋白质多样性和复杂性分析的需要,必须对磷酸化蛋白/多肽采用蛋白质组学技术和生物信息学技术来进行高通量的组学研究。

Zarei等[11]通过组合静电斥力-亲水相互作用色谱(ERLIC)和强阳离子交换(SCX)两种不同的色谱技术,结合固相萃取对磷酸化蛋白质组学进行研究。基于肽的两种相反的理化性质,顺序偶联两种不同的色谱技术,从而提高对多磷酸化肽的分馏效率。具体步骤分为两步:第一步,由于多磷酸化肽磷酸化位点带有大量的负电荷,受静电斥力-亲水相互作用而被分离;第二步,从ERLIC流出的单磷酸化肽因带正电荷,经过强阳离子交换后而离析。这一策略提供了一种强有力的、简单快速实现磷酸化肽初步分馏的方法,整个工作流程仅需2 h就可完成,而且经济实惠、适应性强(样品量多量少皆可),还可实现多通道样品制备。

斑马鱼常常作为动物模型来研究脊椎动物发育及器官形成。近期研究表明,将近70%的人类基因组与斑马鱼基因组相似,而且,84%引起人类疾病的基因与斑马鱼基因相同。Kwon等[12]根据斑马鱼胚胎的透明性、个体大和成型快速等特点,采用TiO2从其胰酶解液中选择性富集磷酸化肽,并对其蛋白质组学的整体磷酸化模式进行RP-LC-MS/MS研究。在斑马鱼胚胎发育过程中,他们从2 166个磷酸化蛋白中鉴定出3 500个不重复的磷酸化位点以及1 564个磷酸化蛋白进行定量化。丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点分布规律分别为88.9%、 10.2%和0.9%。通过Motif-X分析对可能的激酶模体(Motif)进行预测,在80%已鉴定的磷酸化位点中,脯氨酸定向模体出现最频繁,其次是pSF模体。上述工作基于斑马鱼胚胎发育的动态模式创建了6个磷酸化蛋白簇。目前该研究提供了最大规模的斑马鱼胚胎磷酸化蛋白数据,还展现了对斑马鱼胚胎中磷酸化位点和磷酸化蛋白动力学作进一步研究的前景。

参考文献:

[1]Jabeen F, Najam-ul-Haq M, Rainer M, et al. Anal Chem, 2015, 87: 4726

[2]Long X Y, Song Q, Lian H Z. J Mater Chem B, 2015, 3: 9330

[3]Wang Z G, Lv N, Bi W Z, et al. ACS Appl Mater Interfaces, 2015, 7: 8377

[4]Chen Y, Li D J, Bie Z J, et al. Anal Chem, 2016, 88: 1447

[5]Zhu G T, He X M, Chen X, et al. J Chromatogr A, 2016, 1437: 137

[6]Krenkova J, Moravkova J, Buk J, et al. J Chromatogr A, 2016, 1427: 8

[7]Piovesana S, Capriotti A L, Cavaliere C, et al. Anal Chim Acta, 2016, 909: 67

[8]Wang J, Wang Y, Gao M, et al. Anal Chim Acta, 2016, 907: 69

[9]Mansuri M S, Babuta M, Ali M S, et al. Sci Rep, 2016, DOI: 10.1038/srep16969

[10]Ollikainen E, Bonabi A, Nordman N, et al. J Chromatogr A, 2016, DOI: 10.1016/j. chroma.2016.02.063

[11]Zarei M, Sprenger A, Rackiewicz M, et al. Nat Protoc, 2016, 11(1): 37

[12]Kwon O K, Kim S J, Lee Y M, et al. Proteomics, 2016, 16: 136

特别策划: 多尺度靶标的核酸适配体筛选研究进展专栏

引言

核酸适配体特指具有分子识别功能的短序列的单链核酸,也被称为“化学抗体”。它既有可与抗体相当的亲和力和特异性,又有明显优于抗体的特点:可通过化学合成制备,无需动物免疫,成本低;分子性质稳定,能可逆变性与复性,易储存运输;分子量小,易穿过细胞膜,免疫原性低,无明显的毒副作用;靶标范围广泛,包括金属离子、小分子、蛋白质、细胞和微生物等。Web of Science数据库显示,仅2010年以来就有超过5 300篇核酸适配体论文发表,涉及生物医学、分子生物学、化学生物学、分析化学、材料化学、物理学、数学等学科领域。核酸适配体研究具有交叉学科特色,与核酸适配体应用相关的食品、环境和生物分析检测,以及核酸适配体在疾病诊断和治疗、药物研发和分子成像领域的应用潜力正吸引多学科领域研究者的广泛关注。我国学者在核酸适配体研究领域取得大量处于世界前列的研究成果。2009年以来,约300个核酸适配体相关项目获国家重大研究计划以及国家自然科学基金资助。近3年来,在生物、医学、中医药、环境和食品安全检测领域的核酸适配体相关应用研究也在快速增加。

纵观核酸适配体25年的发展,已报道的靶标超过500种,筛选出的核酸适配体超过2 300种。但大量的研究和应用主要集中于一些常见的靶标和特定的核酸适配体。令人满意的具有实际应用价值的核酸适配体数目还非常有限。研究者普遍的共识是,核酸适配体的筛选过程复杂,筛选效率低,且缺少标准化的方法表征适配体的功能,这是目前制约核酸适配体广泛应用的两个瓶颈。

本课题组长期从事毛细管电泳技术的生物医药分析新方法和应用研究。2007年起在国家自然科学基金项目(20875009, 21175011, 21375008)和“973”项目(2007CB914101, 2012CB910603)资助下,从事小分子、蛋白质、细胞和微生物等多尺度靶标的核酸适配体筛选机理和方法研究近十年,建立了基于毛细管电泳技术的核酸适配体筛选和研究平台。本专栏发表的小分子、蛋白质、细胞和微生物靶标的核酸适配体筛选方法综述,将有助于从事核酸适配体筛选研究的学者和应用单位了解核酸适配体筛选的方法和新进展。

本专栏客座主编北京理工大学教授

收稿日期:2016-03-15

DOI:10.3724/SP.J.1123.2016.03020 10.3724/SP.J.1123.2016.02003

*通讯联系人.E-mail:hzlian@nju.edu.cn.