99Tcm-MAG3-isoDGR-2C分子探针的制备与体内分布的实验研究

解朋 黄建敏 张芳 潘莉萍

050051石家庄，河北医科大学第三医院核医学科

99Tcm-MAG3-isoDGR-2C分子探针的制备与体内分布的实验研究

解朋 黄建敏 张芳 潘莉萍

050051石家庄，河北医科大学第三医院核医学科

目的 摸索99Tcm-MAG3-isoDGR-2C分子探针的标记条件并研究其在正常昆明小鼠体内的生物学分布。方法 利用葡庚糖酸盐（GH）转换络合法进行标记，即首先用99Tcm标记GH形成99TcmO-GH中间体，再进行99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的标记；考察pH值和温度等因素对标记率的影响，采用高效液相色谱法鉴定标记物的放射化学纯度；取30只昆明小鼠随机分成6组，分别于注射99Tcm-MAG3-isoDGR-2C 15、30、60、120、240和360 min后测定其在小鼠体内的分布情况。结果 pH值为4.6、反应温度为100℃时的标记率最高（94.2%）。体内分布研究显示该标记物能够较快地从血液中清除，且心、肺、脾、胃、骨等组织的放射性摄取均很少。结论99Tcm-MAG3-isoDGR-2C标记率高、血液清除快，具备一定的成为SPECT显像剂的条件。

分子探针；同位素标记；异天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸；体内分布

恶性肿瘤的发病率逐年上升，而对恶性肿瘤的早诊断和早治疗是影响到恶性肿瘤预后的关键因素，因此，如何对恶性肿瘤进行早期诊断和治疗是目前研究的热点和难点。整合素αvβ3因在肿瘤新生血管中高度表达而在正常血管低表达或不表达，成为了肿瘤相关领域的研究热点。通过噬菌体肽库筛选得到的小分子多肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）具有与整合素αvβ3特异性结合的能力，目前大量的研究用放射性核素131I、99Tcm等对RGD及其衍生模序进行标记，针对恶性肿瘤进行靶向治疗或显像，研究结果表明其具有较好的优越性和潜在的应用价值[1-2]。

除RGD能够与整合素αvβ3特异性结合外，天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg，NGR）小肽分子中的天冬酰胺能够通过脱酰胺作用形成异天冬氨酸（isoAsp，isoD），使NGR变为isoDGR，从而被整合素αvβ3特异性识别并结合[3]。Curnis等[4]通过将含有isoDGR序列的CisoDGRC与TNF融合形成isoDGR-TNF，结果发现无论是单独使用还是联合化疗药物，极低剂量的isoDGR-TNF（1～10 pg）即可以产生对荷淋巴瘤或纤维肉瘤裸鼠的抗肿瘤作用，这种抗肿瘤作用可以通过同时加入过量的游离CisoDGRC得到充分的抑制，而且isoDGR-TNF的抗肿瘤活性明显强于单纯的TNF。因此作者认为isoDGR是一种能够与αvβ3结合的模序。131I标记的isoDGR兔VX2恶性肿瘤SPECT显像研究也表明isoDGR对恶性肿瘤具有一定的靶向性[5]。本研究用99Tcm标记MAG3-isoDGR-2C（其中，MAG3为β-N-巯基乙酰基-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰；C为Cys），探讨最佳标记条件，测定标记物体外稳定性及在正常小鼠体内的生物学分布，为后期的显像和治疗实验提供基础。

1 材料与方法

1．1材料与仪器

材料：99Mo/99Tcm发生器由北京原子高科核技术应用股份有限公司提供；MAG3-isoDGR-2C（图1）由北京中科亚光生物科技有限公司合成，纯度为97．03%；葡庚糖酸盐（glucoheptonate，GH）药盒由北京师宏药物研制中心提供；乙腈（色谱纯）购自北京依诺凯试剂有限公司；三氟乙酸、醋酸、醋酸钠等试剂均购自北京化工厂；聚酰胺薄膜购自浙江台州市路桥四甲生化塑料厂；昆明小鼠（雌性，清洁级，体重18～20 g）购自北京兴隆养殖场。

仪器：FM-2000锝分析仪购自西安凯普机电有限责任公司；Waters 500 TR液相色谱仪购自美国Waters公司；FJ-391型同位素活度计购自北京核仪器厂。

图1 MAG3-isoDGR-2C的分子结构图Fig.1 Molecular structure of MAG3-isoDGR-2C

1．2 MAG3-isoDGR-2C水溶液的配置

1 mg MAG3-isoDGR-2C中加入1 mL注射用水，配置成1 mg/mL的水溶液。

1．399TcmO-GH中间体的制备

利用GH转换络合法行99Tcm标记MAG3-isoDGR-2C前先进行99TcmO-GH中间体的制备。GH药盒中加入1 mL新鲜的Na99TcmO4溶液（240．5 MBq），摇匀后室温放置15 min即可得到99TcmO-GH。采用薄层色谱法鉴定其放射化学纯度，展开剂分别为生理盐水和乙腈，支撑物为聚酰胺薄膜。

1．4 反应温度对标记率的影响

2 mL离心管中加入10 μL MAG3-isoDGR-2C溶液后，加入200 μL pH值为4．6的醋酸-醋酸钠（HAc-NaAc）缓冲液，再加入99TcmO-GH中间体（2．405 MBq），充分摇匀后分别在室温（24℃）及沸水浴（100℃）条件下反应15 min。

采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法进行放射化学纯度的鉴定，流动相为：A相，H2O（含0．1%三氟乙酸）；B相，乙腈（含0．1%三氟乙酸）。淋洗梯度如表1所示。

表1 HPLC法对标记物进行放化纯鉴定的淋洗梯度Table 1 Gradient elution of HPLC in determining the radiation chemical purity of MAG3-isoDGR-2C

1．5 pH值对标记率的影响

2 mL离心管中加入10 μL MAG3-isoDGR-2C溶液后，分别加入200 μL的HAc-NaAc缓冲液（pH值分别为8、6、5．8、4．6），然后加入10 μL99TcmO-GH中间体（2．405 MBq），充分摇匀后100℃反应15 min。参照1．4的方法对其进行鉴定。

1．6 室温稳定性的研究

将标记好的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室温中分别放置30、60、120、240和360 min后，采用HPLC进行放化纯的鉴定，观察其体外的稳定性。

1．799Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠体内的生物学分布研究

将30只昆明小鼠随机分为6组，每组5只，分别经尾静脉注射0．1 mL标记成功的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C（11．1 MBq），分别于注射后15、30、60、120、240、360 min将小鼠断颈处死，迅速收集血液，解剖并取出心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、胃、骨骼、肌肉、肠道、甲状腺等，分别称重并用锝分析仪测定计数，计算各脏器的放射性摄取率（%ID/g）。

2 结果

2．199TcmO-GH中间体的制备

本研究主要采用薄层色谱法对99TcmO-GH中间体进行鉴定，各组分的比移值如表2所示。在两种薄层色谱体系下，各组分的比移值各不同，可以用于鉴定99TcmO-GH中间体。鉴定结果表明，99TcmOGH中间体的放化纯为96．28%，可用于后续多肽的标记。

表2 99TcmO、99TcmO2·nH2O和99TcmO-GH在不同层析体系中的比移值Table 2 Flow rate of the materials in different chromatography systems

表2 99TcmO、99TcmO2·nH2O和99TcmO-GH在不同层析体系中的比移值Table 2 Flow rate of the materials in different chromatography systems

层析体系 99TcmO－4 99TcmO2·nH2O 99TcmO-GH聚酰胺-生理盐水 0～0．1 0～0．1 0．8～1．0聚酰胺-乙腈 0．3～0．6 0～0．1 0～0．1

2．2 温度对99Tcm-MAG3-isoDGR-2C标记率的影响

实验结果表明，在室温条件下反应15 min时，HPLC图上未明显显示出保留时间为24 min的峰，说明在该条件下，MAG3-isoDGR-2C不能够与99TcmO-GH进行配体交换；而在沸水浴（100℃）条件下反应15 min时，在保留时间为24 min附近出现了较高的放射性峰，说明在该条件下能得到99Tcm-MAG3-isoDGR-2C配合物，且标记率为94．2%（图2）。

图2 温度为100℃、pH=4．6时99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的高效液相色谱图Fig.2 Highperformanceliquidchromatogramtodeterminethe radiation chemical purity of MAG3-isoDGR-2C underoptimal conditions

2．3 pH值对99Tcm-MAG3-isoDGR-2C放射化学纯度的影响

实验结果表明，当pH值逐渐减小时，放射化学纯度逐渐增加，即：当pH=8．0和pH=6．0时，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的HPLC图均为多重峰；当pH=5．8时，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的放射化学纯度为86．78%；当pH=4．6时，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C的放射化学纯度为94．2%。

2．499Tcm-MAG3-isoDGR-2C的体外稳定性

标记成功的99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室温中放置360 min后，虽然放射化学纯度有所降低，但仍能够保持在90%以上（图3），表明该标记物在室温条件下稳定性较好。

图3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在室温条件下的稳定性Fig.3 Stability of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in vitro

2．599Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠体内的生物学分布

99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠体内的生物学分布结果如表3所示。由表3可以看出，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在小鼠体内的血液清除较快，在60和120 min时血液里只有0．48和0．33%ID/g，而到240 min时仅剩下0．17%ID/g。各个时间点肾脏的放射性摄取均是最多的，但随着时间的延长，其放射性摄取逐渐减低；而肝脏和肠道的摄取都相对较多，60min时的摄取分别是2．44%ID/g和1．69%ID/g；其余器官的放射性摄取均较低，心脏、肺、脾、胃、骨骼在60 min时的摄取率分别为0．23、0．41、0．19、0．27和0．27%ID/g。

表3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠体内的生物学分布[（±s）%ID/g,n=5]Table 3 Biodistribution of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in normal mice[（±s）%ID/g,n=5]

表3 99Tcm-MAG3-isoDGR-2C在正常小鼠体内的生物学分布[（±s）%ID/g,n=5]Table 3 Biodistribution of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C in normal mice[（±s）%ID/g,n=5]

组织或器官 15 min 30 min 60 min 120 min 240 min 360 min心脏 0.67±0.07 0.41±0.12 0.23±0.01 0.17±0.12 0.08±0.03 0.07±0.03肝脏 4.79±0.46 3.38±0.78 2.44±0.22 2.29±0.37 1.75±0.14 1.74±0.39肺1.68±0.24 0.99±0.21 0.41±0.03 0.35±0.08 0.18±0.03 0.18±0.08肾脏 8.02±1.38 5.95±1.96 3.60±0.32 2.85±0.42 2.11±0.44 2.01±0.96脾0.59±0.06 0.38±0.11 0.19±0.04 0.17±0.05 0.12±0.01 0.07±0.01胃0.49±0.11 0.35±0.10 0.27±0.05 0.25±0.15 0.17±0.31 0.12±0.32骨骼 0.98±0.21 0.65±0.12 0.27±0.07 0.25±0.04 0.16±0.03 0.15±0.05肌肉 0.49±0.07 0.41±0.11 0.16±0.02 0.11±0.03 0.06±0.01 0.04±0.01肠道 2.67±0.61 2.26±0.96 1.69±0.17 0.62±1.03 0.46±0.13 0.20±0.08血2.14±0.31 1.16±0.28 0.48±0.06 0.33±0.03 0.17±0.02 0.15±0.02甲状腺 1.74±0.10 1.20±0.13 0.78±0.05 0.67±0.29 0.46±0.16 0.45±0.24

3 讨论

isoDGR-2C为小分子肽，其相对分子质量为839.79，与大分子蛋白质及多肽相比，其相对分子质量小，具有以下优点：（1）与受体的亲和力可能比受体和受体片段更强；（2）易于合成、易于结构修饰；（3）很少引起免疫反应；（4）能够有效地避免肝脏、脾脏及肾脏的过度摄取，而且快速的血液清除可以提供高靶与非靶比值，改善显像质量。在isoDGR两端加入半胱氨酸是为了保护核心多肽（isoDGR）的稳定性，而在小分子肽的分子结构中引入螯合基团MAG3并不影响它们与受体结合的特性，而且更加容易标记。

虽然目前已经有研究者对核素标记的isoDGR进行了相关的研究和报道，但研究使用的放射性核素为131I，而99Tcm与131I比较具有以下优越性[6-7]：99Tcm是临床上最常用的放射性核素，其具有优良的核素性能，是纯γ光子发射体，得到的SPECT图像质量更加清晰；99Tcm半衰期为6.02 h，为前期放射性显像剂的合成预留了足够时间；通过99Mo/99Tcm发生器制备，容易获得；标记过程相对简单。另外，131I进行标记的过程中还需要对标记物进行纯化，这不利于后期试验的开展。

采用转换络合法进行放射性核素99Tcm对多肽的标记具有能够较好地保持多肽的生物学活性的优点[8-10]，因此，本研究采用GH转换络合法进行放射性核素99Tcm标记MAG3-isoDGR-2C，在对标记条件进行优化后，得到了放射化学纯度达到94%以上的配合物，且标记方法相对简单，体外稳定性好。

体内生物学分布的研究显示了该标记物能够较快地从血液中清除；肾脏的放射性摄取在各个时间点都是最多的，但随着时间的延长，其放射性摄取也在逐渐降低，说明该标记物主要经泌尿系统排泄，这可能与其具有较高的水溶性有关；而肝脏和肠道的摄取都相对较多，这可能是因为该标记物需要从肝脏进行代谢，进而通过肠道排出体外所致；心脏、肺、脾、胃、骨骼等的放射性摄取都很少，这能够有效地减低本底的摄取。

总之，99Tcm-MAG3-isoDGR-2C具备一定的成为SPECT显像剂的基础，而本研究为后续的该标记物在荷瘤鼠体内的生物学分布以及SPECT显像研究提供了基础和实验准备。

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 解朋、黄建敏负责研究命题的提出、设计、论文起草；张芳、潘莉萍负责数据的获取、研究过程的实施。

［1］Lee JW,Park JA,Lee YJ,et al.New glucocyclic RGD dimers for positron emission tomography imaging of tumor integrin receptors[J]. CancerBiotherRadiopharm,2016,31（6）：209-216.DOI：10.1089/ cbr.2016.2015.

［2］Kim YI,Yoon HJ,Paeng JC,et al.Prognostic value of68Ga-NOTARGD PET/CT for predicting disease-free survival for patients with breast cancer undergoing neoadjuvant chemotherapy and surgery：a comparison study with dynamic contrast enhanced MRI[J]. Clin Nucl Med,2016,41（8）：614-620.DOI：10.1097/RLU. 0000000000001274.

［3］Takahashi S,Leiss M,Moser M,et al.The RGD motif in fibronectin is essential for development but dispensable for fibril assembly[J].J Cell Biol,2007,178（1）：167-178.DOI：10.1083/jcb.200703021.

［4］Curnis F,Sacchi A,Gasparri A,et al.Isoaspartate-glycine-arginine：a new tumor vasculature-targeting motif[J].Cancer Res,2008, 68（17）：7073-7082.DOI：10.1158/0008-5472.CAN-08-1272.

［5］洪愉,曾韦锟,赵明玄,等.靶向整合素αvβ3受体isoDGR-2CY的131I标记与生物活性评价[J].西南国防医药,2013,23（10）：1048-1051.DOI：10.3969/j.issn.1004-0188.2013.10.002. Hong Y,Zeng WK,Zhao MX,et al.131I labeling and bioactivity evaluation for receptor isoDGR-CY of targeting integrin αvβ3[J].Med J Nat Defen Force SW Chin,2013,23（10）：1048-1051.

［6］Lahorte CM,Vanderheyden JL,Steinmetz N,et al.Apoptosis-detecting radioligands：current state of the art and future perspectives[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging,2004,31（6）：887-919.DOI：10. 1007/s00259-004-1555-4.

［7］张迎强,蔡炯,李方,等.荷肉瘤小鼠肿瘤细胞凋亡显像实验研究[J].医学研究杂志,2007,36（2）：30-33.DOI：10.3969/j.issn. 1673-548X.2007.02.011. Zhang YQ,Cai J,Li F,et al.The experimental study on apoptosis imaging in sarcoma-grafted mice[J].J Med Res,2007,36（2）：30-33.

［8］Tesic M,Sheldon KM,Ballinger JR,et al.Labelling small quantities of monoclonal antibodies and their F（ab′）2fragments with technetium-99m[J].Nucl Med Biol,1995,22（4）：451-457.DOI： 10.1016/0969-8051（94）00132-4.

［9］Ruan C,Wang Q,He G,et al.Radioimmunoimaging of arterial and venous thrombi in canine model using99mTc labeled monoclonal antifibrin antibody[J].Chin Med J（Engl）,1997,110（1）：69-72.

［10］季顺东,方纬,范磊,等.99Tcm标记人源化抗人血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ21F（ab）2血栓栓塞显像[J].中华核医学杂志,2007,27（3）：173-176.DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-2848.2007.03.013. Ji SD,Fang W,Fan L,et al.Imaging of thromboembolism with99Tcm-SZ21F（ab）2,a humanized anti-platelet glycoproteinⅢa monoclonalantibodyF（ab）2fragment[J].Chin J Nucl Med,2007,27（3）：173-176.

Labeling MAG3-isoDGR-2C with99Tcmand its biodistribution in mice

Xie Peng,Huang Jianmin, Zhang Fang,Pan Liping
Department of Nuclear Medicine,the Third Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China

Huang Jianmin,Email：jm_huang2003@126.com

ObjectiveTo analyze the feasibility of labeling MAG3-isoDGR-2C with99Tcmand investigate the biodistribution of the tracer in normal mice.MethodsGlucoheptonate was initially labeled with99Tcmas the intermediate,followed by MAG3-isoDGR-2C.High-performance liquid chromatography was employed to determine the radiochemical purity.The biodistribution of99Tcm-MAG3-isoDGR-2C was studied at 15,30,60,120,240 and 360 min after caudal vein injection in normal mice.ResultsMAG3-isoDGR-2C was successfully labeled with99Tcm,and the radiochemical purity was 94.2%.The biodistribution revealed that the tracer was rapidly cleared out from the blood with mild activity in the heart,lung,spleen,stomach,and bone.Conclusions MAG3-isoDGR-2C was labeled with99Tcmwith high radiochemical purity,and the tracer could be cleared out quickly.Therefore,MAG3-isoDGR-2C is a potential molecular tracer in the study of early cancer diagnosis.

Molecular probes;Isotope labeling;IsoAsp-Gly-Arg;BiodistributionFund program：Natural Science Foundation of Hebei Province（H2014206286）

黄建敏，Email：jm_huang2003@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.05.004

河北省自然科学基金（H2014206286）

2016-07-29）