小鼠睾丸中细胞连接相关蛋白质的分析

付　俊，罗艳云，缪时英，王琳芳

中国医学科学院基础医学研究所　北京协和医学院基础学院　医学分子生物学国家重点实验室

生物化学与分子生物学系，北京 100005



·论著·

小鼠睾丸中细胞连接相关蛋白质的分析

付俊，罗艳云，缪时英，王琳芳

中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室

生物化学与分子生物学系，北京 100005

摘要：目的探讨细胞连接相关蛋白在不同发育阶段小鼠睾丸中的表达模式。方法Western blot检测并分析1～6周龄小鼠睾丸、原代支持细胞以及小鼠精原细胞系GC1 spg、精母细胞系GC2 spg、间质细胞系TM3、支持细胞系TM4等4种生殖相关细胞系中细胞连接相关蛋白的表达水平。结果小鼠睾丸曲细精管中支持细胞间细胞连接相关膜蛋白连接黏附分子A、紧密连接蛋白Occludin和Claudin，以及支持细胞-生精细胞间细胞连接相关膜蛋白连接黏附分子C、连接蛋白Nectin- 3和钙黏附蛋白E的表达表现出明显的阶段特异性。而参与细胞连接的调节蛋白紧密连接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β链蛋白和CD2相关蛋白在睾丸的不同发育阶段以及生殖细胞系中表达无差异。结论小鼠睾丸曲细精管中支持细胞间以及支持细胞-生精细胞间细胞连接相关的膜蛋白多表现出明显的阶段特异性。而参与细胞连接的调节蛋白在睾丸的不同发育阶段中表达无差异。

关键词：血睾屏障；支持细胞间连接；支持细胞-生精细胞间连接；膜蛋白；调节蛋白

ActaAcadMedSin，2016,38(2)：205-209

在小鼠睾丸曲细精管中，支持细胞为包括精原细胞、精母细胞和精子细胞在内的生精细胞提供营养并精细调控着各级生精细胞的发育，相邻的支持细胞通过建立血睾屏障形成免疫屏障，将机体的免疫系统和精子抗原分隔开，避免发生自身免疫性疾病同时保证精子发生所需的微环境。在特定的时间，支持细胞间的血睾屏障打开，由精原细胞分化而来的早期精母细胞从近基底的小室越过血睾屏障迁移至近管腔的小室，精母细胞在靠近管腔的小室发生减数分裂并进一步发育为成熟的精子[1]。支持细胞间建立的血睾屏障由紧密连接和包括基底外质特化的锚定连接等多种细胞连接组成，支持细胞-生精细胞间形成顶部外质特化的锚定连接[2]。当睾丸先天发育受损或受到外界环境刺激，支持细胞间或者支持细胞-生精细胞间连接的相关蛋白质可能发生改变。参与支持细胞间细胞连接蛋白质早已被学者广泛研究，比如膜蛋白连接黏附分子A、紧密连接蛋白Occludin和Claudin等；支持细胞和精子细胞间的细胞连接分子包括膜蛋白连接黏附分子C、连接蛋白Nectin- 3和钙黏附蛋白E等。膜蛋白钙黏附蛋白N同时参与到两种细胞连接中。膜内调节蛋白紧密连接蛋白(zonula occludens，ZO)- 1、ZO- 2、Afadin、β链蛋白和CD2相关蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)与膜蛋白相互作用广泛的调节多种细胞连接[3]。本研究拟在小鼠睾丸中分析上述多种细胞连接相关蛋白质的表达规律。

材料和方法

材料C57健康雄性小鼠购自维通利华公司。兔抗紧密连接蛋白ZO- 2、CD2相关蛋白、Afadin、钙黏附蛋白E和β链蛋白抗体购自CST公司。兔抗紧密连接蛋白ZO- 1、连接黏附分子A、紧密连接蛋白Occludin抗体，胶原酶Ⅰ，透明质酸酶购自Invitrogen公司。羊抗连接蛋白Nectin- 3抗体和兔抗钙黏附蛋白N抗体购自Santa Cruz公司。兔抗连接黏附分子C、紧密连接蛋白Claudin 1和Claudin 11抗体购自Abgent公司。兔抗微管蛋白Tubulin抗体购自Bioworld公司。小鼠精原细胞系GC1 spg、精母细胞系GC2 spg、间质细胞系TM3、支持细胞系TM4购自美国模式菌种收集中心，由实验室保存。

小鼠睾丸的分离将小鼠断颈处死，打开腹腔，取下睾丸，用磷酸缓冲液洗1次，迅速放入冻存管并置于液氮。

小鼠睾丸支持细胞的分离新鲜的3周龄小鼠睾丸，剥去白膜于磷酸缓冲液中洗2遍，胶原酶Ⅰ中消化2次。DMEM/F12完全培养基终止消化。加入磷酸缓冲液，自然沉降后去上清，重复2～3遍。沉淀转移至细胞培养皿，剪碎组织，加入透明质酸酶消化。800×g 离心5 min，去上清，细胞沉淀用DMEM/F12培养基重悬接种至细胞培养皿中，于37℃孵箱中培养，24 h后换液。换液24 h后低渗处理[4]。

Western blot检测样品中蛋白质的表达样品电泳后转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，洗膜后封入酶标二抗孵育1～2 h，洗膜并显色。

结果

小鼠睾丸中细胞连接相关膜蛋白的表达在1～6周小鼠睾丸中，支持细胞间细胞连接相关膜蛋白的表达模式多有不同(图1A)。连接黏附分子A在小鼠幼年期睾丸中表达量较高，2周龄时达到峰值。紧密连接蛋白Occludin与连接黏附分子A明显不同，小鼠幼年期睾丸中基本不表达，至4周龄睾丸开始表达并逐渐增加。紧密连接蛋白Claudin 1和Claudin 11主要在1～2周龄小鼠睾丸中表达。Claudin 1在1周龄睾丸中最多，而Claudin 11在2周龄时大量表达。钙黏附蛋白N在1～6周龄小鼠睾丸中均有表达，1周龄时表达量略多。支持细胞-生精细胞间细胞连接相关蛋白质的表达模式也有特异性(图1A)。连接黏附分子C从2周龄小鼠睾丸中开始表达，并随周龄逐渐增加。连接蛋白Nectin- 3在幼年期睾丸中基本不表达，4周龄中开始明显表达并随睾丸发育增加。钙黏附蛋白E在幼年期小鼠睾丸中表达较多，3周龄后表达逐渐减少。

小鼠睾丸中细胞连接相关调节蛋白的表达在1～6周龄小鼠睾丸细胞连接相关调节蛋白中，紧密连接蛋白ZO- 1和ZO- 2在各周龄表达比较均等，Afadin在2～4周龄小鼠睾丸中表达轻微增加，β链蛋白和CD2相关蛋白在1～3周龄小鼠睾丸中表达轻微增加(图1B)。

小鼠睾丸原代支持细胞中细胞连接相关蛋白质的表达从3周龄小鼠睾丸中分离原代支持细胞，并用特定的marker SOX9确定。在原代支持细胞中，检测到支持细胞间细胞连接相关的膜蛋白包括连接黏附分子A、紧密连接蛋白Claudin 11和钙黏附蛋白N以及调节蛋白包括紧密连接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β链蛋白、CD2相关蛋白均有表达，其中连接黏附分子A、紧密连接蛋白Claudin 11和β链蛋白表达量较大，而膜蛋白包括紧密连接蛋白Occludin和Claudin 1未检测到表达(图2A、2B)。在原代支持细胞中，支持细胞-生精细胞间细胞连接相关的膜蛋白只有钙黏附蛋白E表达，连接黏附分子C和连接蛋白Nectin- 3无表达(图2A、2B)。

JAM：连接黏附分子；ZO：紧密连接蛋白；CD2AP：CD2相关蛋白；Mr：相对分子质量；1～6：1～6周小鼠睾丸JAM：junctional adhesion molecule；ZO：zonula occludens；CD2AP：CD2-associated protein；Mr：relative molecular mass；1- 6：1- 6-week mouse testes

A.细胞连接相关膜蛋白的表达；B. 细胞连接相关调节蛋白的表达

A. expressions of membrane proteins associated with cell junctions；B. expressions of adaptor proteins associated with cell junctions

图 11～6周小鼠睾丸中细胞连接相关蛋白质的表达

Fig 1Expressions of proteins associated with cell junctions in 1- 6-week mouse testes

小鼠生殖细胞系中细胞连接相关蛋白质的表达在小鼠生殖细胞系GC1、GC2、TM3和TM4中，膜蛋白包括钙黏附蛋白N以及调节蛋白紧密连接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β链蛋白和CD2相关蛋白在4种细胞系中均有表达，连接黏附分子A在GC1细胞系中有表达，支持细胞间膜蛋白包括紧密连接蛋白Occludin、Claudin 1和Claudin 11在4种细胞系中无表达(图2C、2D)。支持细胞-生精细胞间细胞连接相关的膜蛋白连接黏附分子C、连接蛋白Nectin- 3和钙黏附蛋白E在4种细胞系中无表达 (图2C、2D)。

讨论

小鼠出生后，睾丸需进一步发育并成熟，16 d时小鼠睾丸支持细胞间出现与血睾屏障有关的细胞连接复合物，至20 d左右支持细胞间血睾屏障形成[3]，血睾屏障成熟后睾丸中生精细胞才能发生减数分裂，大量的生精细胞不断增加使睾丸中支持细胞的比例随睾丸发育而降低，因此3周龄是分离原代支持细胞的最佳周龄。有研究显示小鼠1周龄睾丸中支持细胞比例占到3/4，2周龄时下降至37%，3周龄下降至28%，成年后仅有3%[5]。因此，在不同发育阶段的小鼠睾丸样品中，部分细胞连接相关蛋白可能因睾丸发育中支持细胞的比例降低而相对减少。本研究主要探讨参与支持细胞间细胞连接的膜蛋白包括连接黏附分子A、紧密连接蛋白Occludin、Claudin 1、Claudin 11和钙黏附分子N，参与支持细胞-生精细胞间细胞连接的膜蛋白包括连接黏附分子C，连接蛋白Nectin- 3和钙黏附蛋白E，膜内调节蛋白包括紧密连接蛋白ZO- 1、ZO- 2、Afadin、β链蛋白和CD2相关蛋白在小鼠睾丸不同发育阶段的表达模式。

紧密连接蛋白Occludin是第1个被发现存在于紧密连接处的膜蛋白，有4个跨膜结构，临近细胞的细胞连接处，两个细胞的Occludin的胞外环区相互结合形成复合物[6]。Occludin敲除小鼠不育，但幼年期睾丸未发现异常[7]。虽然4周龄后小鼠睾丸中支持细胞的比例不断降低，但本研究显示Occludin主要在4周龄以后的小鼠睾丸中表达，表明其主要发挥作用于成熟后的支持细胞的细胞连接中，这与Occludin敲除小鼠幼年期睾丸发育正常呼应。

Tes- 3：3周龄睾丸；Tes- 5：5周龄睾丸；SC：原代支持细胞；GC1：精原细胞系GC1 spg；GC2：精母细胞系GC2 spd；TM3：间质细胞系；TM4：支持细胞系

Tes- 3：3-week testes；Tes- 5：5-week testes；SC：primary sertoli cells；GC1：spermatogonia cell line GC1 spg；GC2：spermatocyte cell line GC2 spg；TM3：leydig cell line；TM4：sertoli cell line

A、C.细胞连接相关膜蛋白的表达；B、D.细胞连接相关调节蛋白的表达

A，C. expressions of membrane proteins associated with cell junctions；B，D. expressions of adaptor proteins associated with cell junctions

图 2原代小鼠睾丸支持细胞和生殖相关细胞系中细胞连接相关蛋白质的表达

Fig 2Expressions of proteins associated with cell junctions in primary sertoli cells and in reproductive related cell lines

膜蛋白连接黏附分子JAM胞外区含有两个免疫球蛋白样的环，定位于上皮细胞或者内皮细胞间的紧密连接处[8]。紧密连接蛋白Claudin有4个跨膜结构，其表达和定位受包括激素和炎症因子等很多因素的调节[6]。Claudin 11敲除小鼠睾丸支持细胞间的紧密连接消失并且小鼠不育[6]。在血睾屏障处，连接黏附分子A或者Claudin均与调节蛋白紧密连接蛋白ZO- 1和ZO- 2相互作用并被后两者调节[3]。本研究显示连接黏附分子A、紧密连接蛋白Claudin 1和Claudin 11在幼年期睾丸即血睾屏障建立早期表达量较高，提示三者在血睾屏障的建立中发挥重要功能。在原代分离的支持细胞中，连接黏附分子A和Claudin 11的表达量显著高于小鼠睾丸，可能因二者高表达于睾丸支持细胞中，在支持细胞被分离纯化后，连接黏附分子A和紧密连接蛋白Claudin 11两个蛋白也相对被富集。

钙黏附蛋白N主要定位于支持细胞间的细胞连接处，在一些特定时期还定位于支持细胞-生精细胞间的细胞连接处，而钙黏附蛋白E大量定位于生精细胞中[7]。钙黏附蛋白-链蛋白复合物对于钙黏附蛋白Cadherin介导的细胞黏附是必需的。在睾丸中，链蛋白定位于支持细胞间的血睾屏障处以及支持细胞与精原细胞或者精母细胞的细胞连接处[6]。CD2相关蛋白在睾丸曲细精管支持细胞间的细胞连接处与钙黏附蛋白N、β链蛋白和紧密连接蛋白ZO- 1等相互作用。CD2相关蛋白敲除小鼠血睾屏障被破坏，并导致精子发生障碍[9]。β链蛋白和CD2相关蛋白在1～3周龄小鼠睾丸中表达量相对于后期略高，可能因睾丸发育过程中支持细胞的比例逐渐降低有关。

连接黏附分子C表达于发育中的圆形和长形精子中，定位于支持细胞-精子细胞的细胞连接处。在连接黏附分子C敲除小鼠中，成熟的精子细胞消失，表明其在精子发生中有必要的功能[8，10]。与连接黏附分子C类似，连接蛋白Nectin- 3表达于长形精子中，定位于支持细胞- 生精细胞的细胞连接处[7]。Nectin- 3敲除小鼠中精子细胞的极性缺失[8]。Afadin与Nectin在胞内形成复合物，并调节其功能。在支持细胞-生精细胞间细胞连接中Afadin与Nectin- 3相互作用[11]。本研究显示随着睾丸发育，连接黏附分子C和Nectin- 3依次开始表达。连接黏附分子C和Nectin- 3主要由支持细胞-精子细胞连接处的生精细胞表达，因此在分离的原代睾丸支持细胞中未检测到表达。

本研究显示参与细胞连接的调节蛋白在睾丸的不同发育阶段以及生殖细胞系中表达基本均衡。而不论是支持细胞间还是支持细胞-生精细胞间细胞连接相关的膜蛋白多表现出明显的阶段特异性，并且这些膜蛋白在生殖细胞系中基本不表达，提示这些膜蛋白的表达受到精细的调控，同时需要睾丸微环境的调节。细胞连接相关蛋白多与器官发育和生育力密切相关[12]，本研究结果为深入了解精子发生过程中细胞连接相关蛋白的作用提供了重要信息。

参考文献

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Expression Patterns of the Proteins Associated with Cell Junctions in Mouse Testes

FU Jun，LUO Yan-yun，MIAO Shi-ying，WANG Lin-fang

State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Department of Biochemistry and Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences & School of Basic Medicine Peking Union Medical College，Beijing 100005，China Corresponding author：WANG Lin-fangTel：010- 69156418，E-mail：wang.linfang@imicams.ac.cn

ABSTRACT：ObjectiveTo study on the expression patterns of proteins associated with cell junctions in the developing mouse testes. MethodThe expression levels of reproductive related cell lines spermatogonia cell line GC1 spg，spermatocyte cell line GC2 spg，leydig cell line TM3，and sertoli cell line TM4, primary sertoli cells,and 1- 6-week mouse testes were analyzed using Western blot. ResultsThe sertoli cell junction-associated membrane proteins adhesion molecule A，Occludin and Claudin，and the sertoli-germ cell junction-associated membrane proteins junctional adhesion molecule C，Nectin- 3，and E-cadherin were stage-specific in the seminiferous tubules in the mouse testes. The adaptor proteins associated with cell juctions zonula occludens- 1，zonula occludens- 2，Afadin，β-catenin，and CD2-associated protein were not stage-specific in the seminiferous tubules in the mouse testes. ConclusionsIn the seminiferous tubules in the mouse testes，the membrane proteins associated with cell junctions are stage-specific. However，the expressions of adaptor proteins associated with cell junctions do not obviously change.

Key words：blood-testis barrier；sertoli cell junctions；sertoli-germ cell junctions；membrane proteins；adaptor proteins

(收稿日期：2015- 09- 15)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.02.014

中图分类号:Q249

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)02- 0205- 05

通信作者：王琳芳电话：010- 69156418，电子邮件：wang.linfang@imicams.ac.cn

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金(31401273)和国家重大科学研究计划(2012CB944902)Supported by Grand for the Youth from National Natural Science Foundation of China(31401273)and the National Important Research Plan of China(2012CB944902)