氧化苦参碱对H2狾2诱导L02细胞损伤的抑制作用及其机制的研究

韩延忠　周永峰　桑秀秀　刘慧敏　崔鹤蓉　孟雅坤　李光全　贺兰芝　尹萍　王伽伯　柏兆方　肖小河

[摘要]该文研究氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）抑制H2O2诱导的L02细胞损伤的作用及其机制。以人正常肝实质细胞L02为研究对象，采用H2O2诱导氧化应激建立肝损伤模型进行实验，通过CCK8检测OMT对L02细胞活性的影响；CSFE荧光实验检测OMT对L02细胞增殖的影响；流式细胞术检测OMT对H2O2诱导的L02细胞凋亡率的影响；DCFHDA荧光探针检测OMT对H2O2诱导的L02细胞内ROS含量；微板比色法检测OMT对GSHPX和SOD活性的影响。结果显示，OMT在625～100 mg·L-1通过诱导NADPH的产生，增强L02细胞内GSHPX酶和SOD酶的活性，进而促进GSH介导的活性氧ROS的清除，从而抑制H2O2诱导的L02细胞凋亡的发生，达到抑制H2O2诱导L02细胞损伤的作用。

[关键词] 山豆根；氧化苦参碱；H2O2；氧化应激；过氧化物酶

[Abstract]To investigate the protective effects of oxymatrine （OMT） against H2O2induced damage in L02 cells and research the mechanism，L02 cells were used as the research object. The oxidative stress model of L02 was established by hydrogen peroxide （H2O2） CCK8 was used to detect the cell activation of L02 cells treated by different OMT FCM （flow cytometry） assay was used to evaluate the cell proliferation of L02 cells treated by OMT The apoptosis of L02 cells was detected using AnnexinV/7AAD apoptosis detection kit The level of ROS was detected by DCFHDA fluorescence probe The GSHPX and SOD were detected by micro plate and colorimetric method Results showed that when the concentration of OMT is between 625 and 100 mg·L-1， it could promote the production of NADPH and strengthen the activity of GSHPX and SOD to get rid of the ROS to protect the L02 cell from the apoptosis of L02 cell induced by H2O2

[Key words]Subprostrate sophora； oxymatrine； H2O2； oxydatve stress； peroxydase

doi：10.4268/cjcmm20160723

近年来肝病发生率的逐年上升已引起社会的广泛关注，是我国目前较为严重的公共卫生问题之一。肝病的发生必然会引起肝实质细胞的损伤，而活性氧引发的氧化应激又是多种肝病发生的病理基础[1]，如脂肪肝、酒精肝、病毒性肝炎、肝纤维化等[25]，因此氧化应激在肝病发生发展中的作用不容小觑。山豆根为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gapnep的干燥根和根茎，是一种清热解毒类中药，苦参碱类物质是山豆根的主要化学成分之一[6]。研究发现，苦参碱类成分具有良好的保肝降酶作用，能防止多种原因引起的肝损伤，例如氧化苦参碱可以抑制四氯化碳引起的化学性肝损伤[7]、爆发性肝损伤[8]、缺血再灌注肝损伤[9]、病毒性肝损伤[10]。而上述各种类型的肝损伤各种机制间相互影响，错综复杂。例如国际上公认的脂肪肝发病机制“二次打击学说”：是指在氧化应激和免疫细胞因子2个方面共同作用，相互影响下，引起脂肪性肝炎，进而发展成肝纤维化和肝硬化的过程[1]。近年来氧化苦参碱保肝作用的研究主要侧重于其免疫调节作用，抗氧化保肝作用的报道较少。本研究通过建立H2O2诱导的L02细胞氧化应激肝细胞损伤模型，研究氧化苦参碱的抗氧化作用及其保护机制，为深入研究其在多种肝病治疗上的应用提供依据。

1材料

正常人肝细胞株L02细胞购自江阴康众康民生物医药技术有限公司。用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基在37 ℃，5% CO2且饱和湿度条件下进行常规培养。

DMEM完全培养基购自Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素均购自GIBCO公司；过氧化氢（H2O2）购自Sigma公司；Cell Counting Kit8（CCK8）购自东仁化学科技（上海）有限公司；ANNEXINⅤFITC/7AAD apoptosis detection kit购自美国贝克曼公司；CFSE Cell Division Tracker Kit购自Biolegend公司；氧化苦参碱（OMT）购自中国食品药品检定研究院；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、活性氧检测试剂盒（reactive oxygen species kit）、BCA蛋白浓度检测试剂盒（BCA protein assay kit）、谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（cellular glutathione peroxidase assay kit）均购自碧云天生物技术公司。

酶标仪（BioTek Synergy H1 H1MFD， 美国）；二氧化碳培养箱（NAPCO Model 5410，美国）；台式低速离心机（TD5A，湖南赫西仪器装备有限公司）；流式细胞仪（BD FACS Canto Ⅱ）。

2方法

21L02细胞的培养L02细胞培养按照常规培养的方法，含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 g·L-1链霉素的高糖培养基 DMEM，37 ℃，5% CO2培养箱培养。

22CCK8检测OMT对L02细胞活性的影响为了排除OMT对L02细胞毒性的剂量范围，将L02细胞以70×104个/mL接种到96孔板，每孔100 μL，接种12 h细胞全部贴壁后，分别给质量浓度为3 200，1 600，800，400，200，100，50，25，125，625，312，156 mg·L-1的OMT， 实验设阴性对照孔和空白对照孔，且每个浓度下设5个复孔，24 h后CCK8检测L02细胞的增值率。细胞增值率=（As-Ac）/（Ac-Ab）×100%，式中Ac为对照孔吸光度；As为实验孔吸光度；Ab为空白孔吸光度。

23CSFE染色法检测OMT对L02细胞增殖的影响采用CSFE 染色法对L02细胞进行染色，染色过程严格按照说明书进行。将L02 细胞以10×105个/mL接种到12孔板中，每孔1 mL ， 接种12 h后分别给质量浓度为50，25，125，625 mg·L-1的OMT对L02细胞刺激，每个浓度下设3个复孔。24 h消化细胞，将消化下来的细胞进行流式检测。

24L02细胞氧化应激模型的建立将浓度为70×104个/mL的L02细胞接种到96孔板，每孔100 μL， 接种12 h细胞全部贴壁后，设08，07，06，05，04，03，02，01 mmol·L-1浓度梯度的H2O2进行造模，实验设阴性对照孔和空白对照孔，且每个浓度下设5个复孔，分别在造模05，1，2，3，4 h后用PBS清洗2遍，再用CCK8检测L02细胞的存活率。实验重复3遍。细胞的存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%。

25ANNEXINFITC/7AAD法检测凋亡细胞双氧水建立氧化损伤模型，可以增加胞内ROS水平，进而发生胞内氧化应激反应，最终导致细胞的程序性死亡，即凋亡[15]，因此本实验直接采用流式方法检测细胞凋亡来证明OMT的抗氧化作用。将L02细胞按照10×105个/mL接种到12孔板中，设空白组、模型组和给药组，每孔2 mL，接种12 h后，模型组和给药组分别按照24项下造模条件造模，05 h后，给药组分别给质量浓度为50，25，125，625 mg·L-1的OMT对L02细胞刺激，给药24 h后，将L02细胞消化下来，按照ANNEXINⅤFITC/7AAD说明书方法进行流式检测L02细胞凋亡情况。

26L02细胞内SOD，GSHPX活力测定用6孔板培养L02细胞，分组、造模、给药如前，最后每孔加200 mL PBS，反复冻融法裂解细胞，然后1万r·min-1离心10 min，取上清，按照试剂盒说明书测定吸光度（A），并计算SOD，GSHPX活力。

27L02细胞内ROS含量测定用12孔板培养L02细胞，分组、造模、给药如前，最后清洗细胞，按照试剂盒说明书运用原位装载探针的方法进行胞内染色，染色20 min，用PBS清洗3次，完毕用胰酶消化，加完全培养基终止消化，1 500 r·min-1离心，弃上清，最终用200 μL的PBS重悬。在激发波长488 nm，发射波长525 nm下进行流式检测胞内荧光强度。

28统计分析采用SPSS 200统计软件进行处理，组间差异采用t检验进行处理，P<005表示差异具有统计学意义。

3结果

31CCK8检测OMT对L02细胞活性的影响OMT作用于L02细胞24 h后，OMT质量浓度在32～100 mg·L-1时增强L02细胞活性，并且在125 mg·L-1时对L02细胞活性最强；OMT质量浓度在400～3 200 mg·L-1时对L02细胞有毒性作用，并且随着OMT浓度的增加毒性作用增强（图1）。基于上述结果，本实验采用625，125，25，50 mg·L-1的质量浓度梯度进行后续试验。

32CSFE染色法检测OMT对L02细胞增殖的影响根据CSFE荧光的倍减程度显示，空白对照组在24 h内自然增殖3代，L02细胞被不同浓度OMT刺激24 h后，各个OMT浓度下的L02细胞也增殖3代，与空白组相比，未出现增殖小峰，无统计学差异，说明OMT不能促进L02细胞的增殖（图2，表1）。基于CCK8检测结果和原理，以及CSFE检测结果，表明OMT可以促进L02细胞内NAD（P）H的增加。

33L02细胞氧化应激模型的建立本研究首先考察H2O2浓度和刺激时间对L02细胞损伤的影响，结果显示随着H2O2浓度的增加，L02细胞的存活率逐渐降低，且趋势逐渐趋于平缓；随着造模时间的延长，相同H2O2浓度下的L02细胞的存活率逐渐降低（图3）。综合考虑造模时间和造模浓度，以半数致死量为原则，本研究选择造模时间为05 h和造模浓度为03 mmol·L-1的H2O2进行后续试验。

34ANNEXIN ⅤFITC/7AAD法检测凋亡细胞H2O2造模后L02细胞的凋亡率为256%±36%，较空白组明显增加（P<005）；分别给625，125，25，50 mg·L-1的OMT干预后，凋亡率明显下降，分别为112%±25%，998%±39%，138%±31%，153%±24%（P<005）；凋亡率与给药

浓度呈现一定的剂量依赖关系，并且OMT在125 mg·L-1时抑制凋亡作用最强（图4）。

35L02细胞内SOD，GSHPX活力、ROS含量测定OMT抑制双氧水对L02细胞的损伤中SOD，GSHPX活力变化，与空白组相比，模型组中SOD活性显著降低（P<005），GSHPX活性显著降低（P<001）；与模型组比较，给药组中SOD活性均显著升高（P<005，P<001）、GSHPX活性均显著升高（P<001），且OMT在125 mg·L-1时二者活性升高最多；与正常对照组相比，模型组中ROS

含量显著升高（P<001）；与模型组相比，给药组

4讨论

苦参素（即氧化苦参碱）是从豆科槐属植物苦参、广豆根、管萼山豆根等植物中提取的生物碱，临床上主要用于治疗慢性乙型病毒性肝炎，临床效果确切，是中华医学会重点推广治疗乙型肝炎的药物之一，同时对多种肝损伤也有较好的保护效果[16]。肝病的发生必然会引起肝实质细胞的损伤，活性氧引发的氧化应激又是多种肝病发生的病理基础[1]，近年来氧化苦参碱的保肝作用机制研究主要集中在免疫调节方面，其在整体动物水平的抗氧化保肝作用报道较少。并且相比动物实验的整体性和作用机制的复杂性，细胞实验影响因素比较单一，具有动物整体实验所不具备的优势与特色，能更为直接的说明其抗氧化作用。因此本实验采用H2O2致L02细胞 （肝实质细胞）氧化应激损伤模型，单纯从抗氧化作用方面来探讨氧化苦参碱（OMT）的保肝作用。

CCK8检测法是一种检测细胞增值活性的常用方法，结果显示，L02细胞在接受OMT刺激后，增殖活性增强；而采用CSFE细胞分裂跟踪法检测，结果显示L02细胞未出现增值现象。基于上述2种矛盾的结果分析：CSFE细胞分裂跟踪法是一种更直接检测细胞增殖的方法，其结果更准确，OMT不能促进L02细胞的增殖；CCK8检测法是一种间接检测细胞增殖的方法，其检测原理是通过检测96孔细胞板中NAD（P）H增加的多少来间接说明细胞的增殖。所以CCK8结果表明，L02细胞接受OMT刺激后，实验孔中NAD（P）H总含量增加。综合2种方法的结果，本课题组判断，OMT可以促进单个L02细胞内NAD（P）H含量增加。而NADPH是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分，对于维持GSH的还原状态，保证细胞清除导致细胞氧化损伤的毒性物质ROS具有重要意义 [18]。因此可以推测OMT可能有抗氧化保肝作用。

为此，本课题组采用双氧水建立氧化应激损伤模型来证明上述推测。但是由于H2O2的不稳定性、细胞种类以及人为等因素的存在，不同文章中的H2O2的造模浓度及造模时间存在很大差异[1114]，本实验综合考虑造模时间和造模浓度因素，以半数致死量为原则，最终选择造模时间为05 h和造模浓度为03 mmol·L-1的H2O2进行实验。

基于上述造模条件，再给予一定浓度的OMT刺激，流式细胞术检测发现氧化苦参碱明显降低了L02细胞的凋亡率，且在125 mg·L-1时，凋亡率最小，说明OMT在一定浓度范围内可以抑制H2O2诱导的L02细胞氧化应激导致的凋亡。

DCFHDA荧光探针法检测发现双氧水损伤L02细胞后，模型组产生了大量的活性氧ROS，并且细胞凋亡比例明显增加。SOD，GSHPX均属于内源性的抗氧化酶，可以直接清除活性氧ROS，本实验发现L02细胞被双氧水损伤后，胞内的SOD，GSHPX活性明显降低，给药后，二者活性显著增强，同时胞内ROS含量明显降低，细胞凋亡比例明显下降，提示OMT可以通过增强SOD，GSHPX活性，从而清除活性氧ROS来降低凋亡的发生。

综上所述，氧化苦参碱OMT可以增强L02细胞内的SOD，GSHPX活性以及NADPH的含量来清除H2O2诱导产生的活性氧 ROS，从而减轻氧化损伤所造成的细胞凋亡。氧化苦参碱或可以作为一种抗氧化保肝药物的前体药物来进一步研发。

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[责任编辑马超一]