茭白线粒体蛋白双向电泳体系建立

杜传来　罗海波　彭昕　王韦华　郁志芳

摘要：【目的】建立适合于茭白线粒体蛋白质组分析的双向电泳技术体系，为进一步开展茭白线粒体差异蛋白质组学研究提供参考。【方法】以茭白为试验材料，比较不同线粒体提取纯化方法、IPG胶条pH范围及蛋白上样量等条件对双向电泳图谱的影响。【结果】差速离心（3000～14000×g）联合Percoll不连续密度梯度离心（20%∶24%∶40%=2∶4∶2）对茭白线粒体的提取纯化效果优于仅采用差速离心。采用改良酚抽法提取茭白线粒体蛋白，17 cm、pH 3～10的IPG胶条，1.0 mg上样量，12% SDS-PAGE进行双向电泳，0.12%考马斯亮蓝G-250胶体考染法染色，茭白线粒体蛋白主要分布在pH 4～8范围内，pH 3～4和pH 8～10范围内蛋白点较少；进一步选用pH 4～7和pH 5～8的IPG胶条对茭白线粒体蛋白进行双向电泳，分离效果均明显提高，且pH 4～7范围内IPG胶条的双向电泳图谱清晰，蛋白点分辨率较高。分别采用0.8、1.0和1.2 mg 3个不同的上样量进行双向电泳，结果表明上样量为1.0 mg时，电泳图谱质量最好。【结论】通过差速离心联合Percoll不连续密度梯度离心提取纯化茭白线粒体，并控制好双向电泳体系的pH范围、上样量等因素，可获得蛋白质点清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。

关键词： 茭白；线粒体；双向电泳；蛋白质组学

中图分类号： Q81 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0332-05

0 引言

【研究意义】线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种重要细胞器，是细胞进行呼吸氧化、电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化的场所，也是产生能量的场所；在信号转导和细胞程序性死亡过程中，线粒体也发挥着重要作用。这些复杂生理功能的实现与线粒体内含有的多种蛋白质密切相关（田世平等，2011；黄凤兰等，2012）。因此，进行线粒体蛋白质组学研究有助于更好地阐明线粒体的生理功能及其在生命活动中的作用。【前人研究进展】目前，国内外关于线粒体蛋白质组学的研究已有相关报道。Millar等（2001）对拟南芥培养细胞的线粒体蛋白进行双向电泳分析，从双向电泳图谱上可分辨出大约100个高丰度线粒体蛋白和250个低丰度线粒体蛋白。Millar等（2004）研究了水稻幼苗在6 d缺氧后1 d有氧适应期和7 d有氧条件下线粒体蛋白的表达差异，发现缺氧条件下呼吸氧化相关酶活性显著升高，同时细胞色素C氧化酶丰度显著低于对照。Qin等（2009a，2009b）研究了苹果和桃果实衰老过程中的线粒体蛋白质组，发现三羧酸循环、电子传递链、碳水化合物代谢及抗胁迫相关蛋白存在表达差异，尤其在高氧胁迫下锰超氧化物歧化酶表达量显著上调。此外，应用线粒体蛋白质组学技术揭示植物细胞质雄性不育机理方面也有研究报道（郭宝健等，2007；陈鹏等，2011）。关于茭白蛋白质组学的研究，目前主要集中在总蛋白质组差异表达方面。Luo等（2012）研究了鲜切茭白冷藏期间的蛋白质表达差异，结果表明，切分诱导了茭白自身抗氧化和抗病原菌系统，但也不可避免地加速了茭白细胞结构的解体和衰老。罗海波等（2014）研究了茭白冷藏期间蛋白质表达谱的变化，发现物质代谢过程的调整、能量代谢途径的改变、活性氧清除能力的减弱及细胞结构的解体可能是导致茭白采后衰老的重要原因。【本研究切入点】植物细胞具有细胞壁，从植物中提取线粒体相对动物细胞而言需增加移除细胞壁的离心程序，限制了植物材料线粒体蛋白质组学的深入研究。目前已有研究针对拟南芥和水稻等模式作物生长发育或胁迫条件下线粒体蛋白质组的变化，但在其他植物材料中有关线粒体蛋白质组学的研究较少，关于茭白线粒体蛋白质组学的研究也未见报道。【拟解决的关键问题】以茭白为研究对象，拟通过对茭白线粒体提取纯化方法及双向电泳条件的优化，建立适合于茭白线粒体蛋白质分离的双向电泳技术体系，为进一步开展茭白线粒体差异蛋白质组学研究提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

試验用茭白购自南京市卫岗菜市场，选择大小一致、无病虫害及机械损伤的茭白，自来水冲洗后剥去外壳叶鞘，迅速用液氮冷冻，-70 ℃保存备用。

主要仪器设备：Beckman高速冷冻离心机（AJ-30i Beckman公司）、Beckman超速冷冻离心机（OptimaL- 100XP Beckman公司）、等电聚焦电泳系统（ProteinI12IEF 美国伯乐公司）、高重复性高通量大型垂直电泳仪（EttanDALTTwelve GE-061-TY7119 GEHealthcare）和ImageScanner Ⅲ扫描仪（28-9076-07 GEHealthcare）。

主要试剂：牛血清蛋白（BSA）、Percoll、Tris平衡酚、两性电解质（Bio-Lyte）、丙烯酰胺（Arc）、N，N'-甲叉双丙烯酰胺（Bis）、考马斯亮蓝G-250等，均为AR级。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 线粒体提取 参照祝美云等（2012）的方法。称取茭白400 g，加入4 ℃预冷的提取液[内含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1%（w/v）BSA、0.5%（w/v）PVP-30、0.1%（w/v）半胱氨酸]800 mL，在组织匀浆机中匀浆3次，每次15 s，然后用4层纱布过滤，滤液在4 ℃下3000×g离心20 min，取上清液在4 ℃下14000×g离心20 min，将沉淀用80 mL洗涤液[内含10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA、0.1% BSA]洗涤，4 ℃下14000×g离心20 min，重复洗涤步骤，得到的沉淀即为粗线粒体。

1. 2. 2 线粒体纯化 参照Qin等（2009b）的方法。将粗线粒体用12 mL悬浮液（内含10 mmol/L Tris-HCl、0.25 mol/L蔗糖、0.3 mol/L甘露醇、1 mmol/L EDTA）懸浮，然后将粗线粒体悬浮液小心铺在20%∶24%∶40%（2∶4∶2）Percoll（10 mmol/L Tris-HCl、0.3 mol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA）不连续密度梯度上，4 ℃下45000×g离心45 min，取24%/40%层不透明浅黄色线粒体环，用50 mL悬浮液洗涤，4 ℃下14000×g离心20 min，重复洗涤步骤，沉淀即为高纯度线粒体。

1. 2. 3 线粒体蛋白提取与含量测定 线粒体蛋白提取纯化参照Luo等（2012）的改良酚抽法进行。在纯化前或纯化后的线粒体沉淀中加入10 mL裂解液[内含50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、2%（v/v）β-巯基乙醇、1 mmol/L PMSF]，冰浴中进行超声波降解30 min，得到线粒体蛋白液。蛋白质含量参照Bradford（1976）的方法进行测定。

1. 2. 4 双向电泳 参照Luo等（2012）的方法。第一向等点聚焦采用17 cm的Bio-Rad公司IPG胶条，等点聚焦pH选取pH 3～10、pH 4～7、pH 5～8等3个梯度，上样体积均为350 μL，上样量分别设置0.8、1.0和1.2 mg。等点聚焦程序：50 V 12.0 h、100 V 1.0 h、200 V 1.0 h、500 V 1.0 h、1000 V 1.0 h、4000 V 2.0 h、8000 V 9.5 h，仪器运行条件为20 ℃，每根胶条极限电流30 μA。聚焦结束后，转入第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶浓度12%，恒定功率每根胶条1 W运行1.5 h，然后每根胶条15 W运行4.0 h，直到溴酚蓝前沿到达凝胶底部终止电泳，用0.12%考马斯亮蓝G-250胶体考染法染色。

1. 2. 5 凝胶图像采集与分析 凝胶图像用ImageScanner Ⅲ扫描仪进行采集，保存为GSC的图像文件，用PDQuest 8.0.1软件进行图像处理。

2 结果与分析

2. 1 线粒体的提取纯化

分别取纯化前的粗线粒体沉淀和纯化后的线粒体沉淀，用改良酚抽法提取线粒体蛋白进行双向电泳分析，比较两种线粒体提取纯化方法对双向电泳效果的影响。如图1所示，仅采用差速离心获得的粗线粒体蛋白经双向电泳后双向电泳图谱（图1-A）清晰，蛋白点较多；而采用差速离心联合Percoll不连续密度梯度离心获得的线粒体蛋白经双向电泳后双向电泳图谱（图1-B）分辨率较高，纯化前双向电泳图谱上出现的部分蛋白质点在纯化后未出现，同时纯化前未出现的蛋白质点在纯化后的双向电泳图谱上清晰显现，表明经Percoll不连续密度梯度离心后线粒体纯度明显提高，同时部分线粒体蛋白质得到有效浓缩。

2. 2 IPG胶条pH范围对双向电泳效果的影响

为获得适合于茭白线粒体蛋白分离的IPG胶条pH范围，用改良酚抽法提取茭白粗线粒体蛋白，采用17 cm、pH 3～10的IPG胶条、1.0 mg上样量、12% SDS-PAGE进行双向电泳，0.12%考马斯亮蓝G-250胶体考染法染色。图2-A显示，茭白线粒体蛋白主要分布在pH 4～8范围内，pH 3～4和pH 8～10范围内蛋白点较少，但pH 4～8范围内的蛋白点过于集中且出现重叠现象，表明pH 4～8可能是茭白线粒体蛋白分离的适宜pH。进一步选用pH 4～7和pH 5～8的IPG胶条对茭白线粒体蛋白进行双向电泳，发现分离效果均明显提高，pH 3～10范围内未分开的点在pH 4～7范围（图2-B）和pH 5～8（图2-C）范围内均能有效分开，且点迹清晰，仅少数高丰度大分子量蛋白点有重叠。图2-B和图2-C还显示，pH 4～7范围内IPG胶条的双向电泳图谱清晰，蛋白点分辨率较高，但pH 7～8范围内存在蛋白点丢失现象；pH 5～8范围内IPG胶条的双向电泳图谱清晰，pH 7～8范围内蛋白点完全分开，但pH 4～5范围内蛋白点丢失，且部分蛋白点仍存在重叠现象，未能有效分开。

2. 3 不同上样量对双向电泳效果的影响

17 cm的IPG胶条采用考马斯亮蓝染色法显色，其适宜的上样量在1.0 mg左右（赵玲玲等，2015）。因此，本研究在其他条件相同的情况下，分别取改良酚抽法获得的茭白粗线粒体蛋白样品0.8、1.0和1.2 mg进行分析。上样量为0.8 mg时，虽然双向电泳图谱背景清晰、蛋白质点较多且无拖尾现象，但低丰度蛋白点很少，部分低丰度蛋白未能在图谱上显现，在一定程度上影响了双向电泳的准确性和重复性（图3-A）；上样量为1.0 mg时，蛋白质点数较多、清晰且分布均匀，低丰度蛋白得到很好呈现，仅少量高丰度大分子量蛋白质存在重叠现象，图谱质量较好（图3-B）；上样量提高至1.2 mg时，低丰度蛋白质点明显增多，但高丰度蛋白质斑点过大，未能有效分开，造成交叉重叠，影响其他蛋白点的分离与分析，甚至出现横向拖尾现象（图3-C）。

3 讨论

3. 1 线粒体提取纯化方法

线粒体的纯度是影响线粒体蛋白质组学研究的重要因素。目前，线粒体分离纯化主要采用差速离心联合密度梯度离心的方法。有研究表明，可使线粒体有效分离的离心力为3000～13000×g，经过多次差速离心也可纯化线粒体，但离心工作量很大且获得的线粒体纯度不高（贺芳和何大澄，2005）。密度梯度离心可将差速离心获得的粗线粒体进一步纯化，有效去除其他细胞器蛋白质的污染，提高纯化效率。密度梯度离心常用的介质主要有氯化铯、蔗糖、Ficoll、Percoll及Nycodenz等，其中蔗糖和Percoll在植物细胞线粒体的分离中较常用（施苏雪等，2012）。Qin等（2009b）采用1200～17000×g差速离心联合8%∶12%∶30%=2∶4∶1 Percoll不连续密度梯度离心和21% Percoll自形成密度梯度离心提取纯化苹果线粒体，获得可用于蛋白质组分析的高纯度线粒体。本研究选用3000～13000×g差速离心联合Percoll不连续密度梯度离心（20%∶24%∶40%=2∶4∶2）后可获得较理想的纯化效果。

3. 2 IPG胶条pH范围

IPG胶条pH范围选择是影响双向电泳图谱蛋白质分辨率和灵敏度的重要因素。合适的IPG胶条pH范围可获得背景清晰、分辨率和灵敏度均较高的双向电泳图谱，反之則可能使分子量和等电点相近的蛋白质难以有效分离，或丢失其pH范围之外的有用蛋白。陈征等（2013）研究比较了不同胶条长度及pH范围对小麦小花线粒体蛋白双向电泳图谱的影响，结果发现蛋白质点主要集中在pH 4～7范围内，采用17 cm、pH 4～7的IPG胶条能够更好地聚焦分离小麦小花线粒体蛋白质组。李建友（2007）对盐胁迫诱导水稻根尖细胞程序性死亡早期线粒体蛋白质组变化的研究表明，pH 4～7是分离水稻根尖细胞线粒体蛋白的适宜范围。而Qin等（2009a）研究发现，桃果实线粒体蛋白质采用pH 3～10范围内的IPG胶条进行双向电泳可获得质量较好的双向电泳图谱。本研究首先采用pH 3～l0的IPG胶条对茭白线粒体蛋白质进行分离，发现茭白线粒体蛋白质主要分布在pH 4～8范围内，因而改用pH 4～7和pH 5～8的IPG胶条进一步双向电泳分离，最终确定采用pH 4～7适宜于茭白线粒体蛋白质的分离，分离效率和分辨率均显著提高。

3. 3 上样量的选择

蛋白质上样量是影响双向电泳图谱清晰度及蛋白质点多少的另一重要因素。上样量过低导致蛋白质点较少，低丰度蛋白颜色较浅且难以发现，造成部分蛋白信息丢失；上样量过高会导致高丰度蛋白点过大而掩盖相对分子质量和等电点相近的其他重要低丰度蛋白（张侨等，2010）。研究表明，上样量不仅与染色方法及IPG胶条长度有关，还与IPG胶条pH范围、高丰度和低丰度蛋白的分布等有关（罗海波等，2013）。因此，在染色方法、IPG胶条长度、上样方法等均一致的条件下，对上样量进行优化是提高双向电泳图谱质量的有效途径。Qin等（2009a）对桃果实线粒体蛋白质双向电泳体系研究表明，采用13 cm、pH 3～10的IPG胶条，最适蛋白上样为0.6 mg。本研究选用17 cm、pH 4～7的IPG胶条、考马斯亮蓝G-250染色，比较了0.8、1.0和1.2 mg不同上样量的双向电泳结果，发现上样量为1.0 mg时得到电泳图谱蛋白质点数量多，分辨率较高，重叠现象少。

4 结论

本研究结果表明，通过差速离心联合Percoll不连续密度梯度离心提取纯化茭白线粒体，并控制好双向电泳体系的pH范围、上样量等因素，可获得蛋白质点清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。

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（责任编辑 王 晖）