甘蔗各家族SPS基因表达特性分析

桂意云 汪淼 秦翠鲜 陈忠良 廖青 李杨瑞 黄东亮

摘要：【目的】通过时空表达特性分析，初步推测甘蔗各家族蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因在甘蔗蔗糖积累途径中的功能，为研究甘蔗各家族SPS基因的生物学功能奠定基础。【方法】采用荧光定量PCR分析甘蔗4个家族SPS基因在高、中、低糖甘蔗品种未成熟叶片、成熟叶片和茎中的时空表达特性。【结果】在甘蔗伸长期、蔗糖积累前期和蔗糖积累后期，SofSPSDⅢ基因在所有甘蔗品种的未成熟叶片、成熟叶片和茎中均高水平稳定表达，相对表达量在5.3～8.1； SofSPSB基因在成熟叶片中几乎不表达，而以茎中表达量最高。在伸长期，SofSPSC和SofSPSA基因表达较强，相对表达量分别为7.3～14.2和1.5～4.4；在蔗糖积累前期，SofSPSC基因表达稍有降低，但仍处于较高水平，相对表达量达为4.6～8.9，而SofSPSA基因表达加强，相对表达量达3.8～6.9；在蔗糖积累后期，SofSPSC基因在成熟叶片中的表达量比蔗糖积累前期下降4.0～7.2倍，且均比未成熟葉和茎中下降约6.0倍，而SofSPSA基因在不同组织中的表达量比蔗糖积累前期下降1.8～5.7倍。各家族SPS基因在不同糖分甘蔗品种间的表达趋势一致。【结论】甘蔗D家族SPS基因维持甘蔗蔗糖合成的基本功能，通过调控C、A家族SPS基因的表达来调控蔗糖合成的强度，B家族SPS基因不参与甘蔗源叶中蔗糖合成而参与蔗糖的积累与利用。

关键词： 甘蔗；蔗糖磷酸合成酶；蔗糖积累；表达特性

中图分类号： S566.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0174-06

0 引言

【研究意义】甘蔗是全球第一大糖料作物和重要的能源作物，也是我国种植面积最大的热带作物。作为我国最重要的糖料作物，蔗糖产量约占全国食糖总产量的90%，其中广西占65%以上。当前我国甘蔗单产60 t/ha、蔗糖分13.7%，与先进国家的80～110 t/ha和15%蔗糖分相比仍有差距。甘蔗是高生物量作物，为异源多倍和非整倍体植物，遗传背景复杂，常规遗传学手段难以阐明其遗传规律，限制了甘蔗糖分性状的进一步改良（李杨瑞，2010）。蔗糖磷酸合成酶（SPS）是植物体内控制蔗糖合成的关键酶（Huber and Huber， 1996），植物体内蔗糖的积累与SPS活性呈正相关（Grof et al.， 2007）；此外，SPS还参与植物的生长和产量形成（Park et al.， 2008； Tian et al.， 2010），并在植物抗逆过程中发挥重要作用（Abdel-latif， 2007； 黄东亮等，2012）。因此，阐明甘蔗SPS基因的生物学功能，对从分子水平上调控SPS基因的表达，改良甘蔗品种具有重要意义。【前人研究进展】Langenkamper等（2002）对高等植物基因组和已知的SPS基因进行生物信息学分析，并将SPS基因分为A、B、C 3个家族；Castleden等（2004）分析单子叶植物的SPS基因，认为单子叶禾本科植物中的SPS基因可分为A、B、C和D 4个家族，D家族又可分为DШ和DⅣ两个亚家族（Castleden et al.， 2004； Lutfiyya et al.， 2007）。各种植物不同家族的SPS基因表达特性各异，其所发挥的功能也不同（Reimholz et al.， 1997）。柑橘A家族的CitSPS1基因在整个发育期的果实中均表达，且在成熟期达到最高；B家族的CitSPS2在果实发育前期（花后187 d）的可食组织中不表达，但在成熟期（花后223 d）表达量达到最高；而C家族的CitSPS3在整个果实发育期的可食组织中均没有转录，推测CitSPS1和CitSPS2在柑橘果实蔗糖的合成或积累方面起重要作用（Komatsu et al.， 1999）。烟草C家族NtSPSC基因只在成熟的源叶中表达，结合RNA干扰技术推测NtSPSC参与非光照条件下淀粉的运输，用于合成蔗糖（Chen et al.， 2005）。【本研究切入点】甘蔗是高光合效率C4作物，其蔗糖含量在所有植物中最高，表明其控制蔗糖合成的关键酶SPS的作用效率极高效。甘蔗是单子叶禾本科植物，所以甘蔗基因组中至少具有4个不同家族的SPS基因，但迄今鲜见有关甘蔗SPS基因家族功能的研究报道。【拟解决的关键问题】分析甘蔗不同家族SPS基因在高、中、低糖甘蔗品种不同组织中的时空表达特性，初步推测甘蔗各家族SPS基因的生物学功能，为进一步阐明甘蔗各家族SPS基因的功能，并通过分子手段调控SPS基因的表达以培育甘蔗高糖品种提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试甘蔗材料分为3个类型，分别包括3个高糖品种（蔗糖分15%～17%）桂糖35号（GT35）、桂糖28号（GT28）和新台糖22号（ROC22），1个中糖品种（蔗糖分12.6%）粤糖71-210（YT71-210），1个低糖品种（蔗糖分6.0%）闽糖86-877（MT86-877）。分别于甘蔗伸长期（7月）、蔗糖积累前期（10月）和蔗糖积累后期（12月）取未成熟叶（未伸展叶，Im leaf）、成熟叶（+2叶，+2 leaf）和茎（+6节，+6 stalk）等样品，清洗擦干后取50～100 mg在液氮中研磨成粉末，用于分析。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 RNA样品制备 用Spin Column Plant total RNA Purification Kit[生工生物工程（上海）股份有限公司]试剂盒提取每个样品的RNA，用RQ1 RNase-Free DNase（Promega， USA）除去RNA样品中的DNA。以1.5%琼脂糖凝胶于1×TAE缓冲液电泳检测RNA完整性，用ND-2000C微量紫外可见分光光度计（美国Thermo）检测RNA浓度。

1. 2. 2 cDNA第一链合成 将提取的RNA以AMV Reverse Transcriptase First Strand cDNA Synthesis Kit[生工生物工程（上海）股份有限公司]反转录合成第一链cDNA。反应体系及程序：在0.2 mL PCR管中加入5.0 μL总RNA、1.0 μL Random Primer（0.2 g/μL）、5.0 μL Rnase-free ddH2O， 70 ℃温浴5 min， 冰浴10 s，离心后加入4.0 μL 5×Reaction Buffer、2.0 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、1.0 μL Rnase inhibitor（20 U/L）、2.0 μL AMV Reverse Transcriptase（10 U/L），总体积为20.0 μL；于37 ℃温浴5 min，42 ℃温浴60 min，最后70 ℃温浴10 min终止反应，将上述溶液于-20 ℃保存。

1. 2. 3 实时荧光定量PCR 以甘蔗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因（EF189713）为内参基因。根据基因SofSPSA（HM854011）（黄东亮等，2011）、SofSPSB（JN584485）（黄东亮等，2013）、SPSC（CA068686）（Grof et al.， 2006）和SofSPSDⅢ（HQ117935）（汪淼等，2014）的序列设计定量PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。内参基因引物：S-GAPDH-F（5'-CTTGCCAAGGTCA

将cDNA样品稀释8倍作为模板，利用荧光定量PCR试剂（2×ABI SybrGreen PCR Master Mix）在ABI STEPONE PLUS型荧光定量PCR仪上检测不同基因的相对表达量。PCR反应体系：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA第一链模板2.0 μL，加6.0 μL ddH2O至总体积20.0 μL。扩增程序： 95 ℃预变性2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，进行40个循环。

2 结果与分析

2. 1 SofSPSDⅢ基因在不同甘蔗品种中的表达特性

通过荧光定量PCR技术检测甘蔗各家族SPS基因在高、中、低糖甘蔗品种不同组织中的时空表达特性，结果表明，在甘蔗伸长期、蔗糖积累前期和蔗糖积累后期，SofSPSDⅢ基因在所有品种中的平均表达量几乎均表现为茎>未成熟叶>成熟叶，且均表现为高水平稳定表达，在不同蔗糖分品种同一部位的表达量没有明显差异，相对表达量在5.3～8.1（图1），其中以蔗糖积累后期表达量更高，其次为伸长期，表明SofSPSDⅢ基因组成型表达，维持甘蔗蔗糖合成的稳定进行。

2. 2 SofSPSA和SofSPSC基因在不同甘蔗品种中的表达特性

在伸长期（7月），甘蔗需要较多的光合产物用于生长发育，各种酶的活性较强，SofSPSA和SofSPSC基因表达也较强；SofSPSA基因相对表达量在1.5～4.4，而SofSPSC基因相对表达量更高，达7.3～14.2。到了蔗糖积累前期（9月），SofSPSC基因表达量稍有降低，但仍处于较高水平，为4.6～8.9；而SofSPSA基因表达量不断加强，达3.8～6.9，使甘蔗蔗糖合成酶的活性处于较高水平。到了蔗糖积累后期（12月），SofSPSC基因在成熟叶片中的表达量明显比蔗糖积累前期下降4.0～7.2倍，比未成熟叶和茎中的表达量下降约6.0倍；而SofSPSA基因在不同组织中的表达量比蔗糖积累前期下降1.8～5.7倍，可能是因为此时甘蔗蔗糖的合成需求下降，不需要太强的SPS活性（图2）。

在所有不同蔗糖分甘蔗品种中，SofSPSC基因在伸长期和蔗糖积累后期均以成熟叶表达量最低，而在茎和未成熟叶中表达量相当。在蔗糖积累前期，SofSPSC基因在不同部位的表达量差异不明显，在MT86-877和YT71-210中均以未成熟叶最高，其次为成熟叶和茎（图2）。在不同时期，SofSPSA基因在所有蔗糖分甘蔗品种中的表达量均表现为成熟叶>未成熟叶>茎（图2）。

2. 3 SofSPSB基因在不同甘蔗品種中的表达特性

成熟叶片是甘蔗进行光合作用、合成蔗糖的源头。在甘蔗伸长期、蔗糖积累前期和蔗糖积累后期，SofSPSB基因在所有品种的未成熟叶片和茎中表达量较高，尤其以茎中表达量最高，而在成熟叶片中均几乎不表达（图3），表明SofSPSB基因不参与甘蔗成熟叶片中蔗糖的合成，而参与蔗糖的积累与利用。

2. 4 不同SPS基因在不同蔗糖分甘蔗品种间的表达趋势

SofSPSDⅢ基因在低糖（MT86-877）、中糖（YT71- 210）和高糖（GT35， GT28和ROC22）品种中的表达表现为：在伸长期和蔗糖积累前期几乎均为茎>未成熟叶>成熟叶，而在蔗糖积累后期几乎均为未成熟叶>茎>成熟叶，且在不同蔗糖分甘蔗品种同一部位的表达量无明显差异（图1）。SofSPSC基因在不同蔗糖分品种甘蔗中的表达，伸长期和蔗糖积累后期均为成熟叶表达量最低，而茎和未成熟叶中表达量相当；在蔗糖积累前期，其在不同部位的表达量差异不明显，也无明显规律性（图2）。在不同取样时期，SofSPSA基因在不同蔗糖分甘蔗品种中的表达表现均为成熟叶>未成熟叶>茎（图2），而SofSPSB基因的表达表现均为茎>未成熟叶>成熟叶（图3）。说明甘蔗各家族SPS基因在低糖（MT86-877）、中糖（YT71-210）和高糖（GT35、 GT28和ROC22）品种的各组织中的表达变化趋势是一致，表明各家族SPS基因在各种糖分甘蔗品种间的表达特性无明显差异。

3 讨论

SPS基因首先在玉米中被成功克隆（Worrell et al.， 1991），随后在菠菜（Klein et al.， 1993）、甜菜（Hesse et al.， 1995）、柑桔（Komatsu et al.， 1996）、蚕豆（Heim et al.， 1996）、水稻（Valdez-Alarcón et al.， 1996）、甘蔗（Sugiharto et al.， 1997； 何文锦等，2007）、文心兰（Li et al.， 2003）和甜瓜（于喜艳等，2007）中相继克隆了SPS基因。进化分析结果表明，植物SPS可分为A、B、C、D 4个家族，而D家族又进一步分为DШ和DⅣ亚家族（Langenkamper et al.， 2002； Castleden et al.， 2004； Lutfiyya et al.， 2007）。在前期研究中，本课题组从NCBI数据库中共获得植物SPS序列77条，其中全长序列43条（黄东亮等，2012）。迄今为止，D家族仅获得5个全长序列的基因，其中，TaSPS9（AF534907）与Castleden等（2004）报道的wheat9为同一基因，被分在DⅢ家族，而SofSPSⅢ（BAA19242）与Lutfiyya等（2007）报道的SofSPS1F（gi854378）为同一基因，也被分在DIII家族。从进化树上看，这5个基因未被进一步分类，所以均为DIII家族SPS基因。因此，根据这5个基因序列克隆获得的D家族SPS基因也为DIII家族，故命名为SofSPSDⅢ（HQ117935）（汪淼等，2014）。由于没有参考序列，本研究没有分析甘蔗DⅣ家族SPS基因的表达特性。

不同植物各家族SPS基因的表达特性不同，它们所发挥的功能也不同（Reimholz et al.， 1997）。水稻OsSPS1基因主要在叶肉细胞、萌发芽胚盾片细胞和未成熟的花粉中表达（Chávez-Bárcenas et al.， 2000）。玉米ZmSPS1、ZmSPS6和ZmSPS7在叶片中表达量很高，而ZmSPS2在叶片和花粉中表达量均很高；ZmSPS3、ZmSPS4和ZmSPS5在各种组织中均低量组成型表达，表明它们负责维持各种组织基本的蔗糖需求（Lutfiyya et al.， 2007）。本研究发现，SofSPSDⅢ基因在所有甘蔗品种的未成熟叶片、成熟叶片和茎中均高水平稳定表达，与Grof等（2007）的研究结果一致。此外，Grof等（2007）的研究结果表明，D家族SPS基因（D1和D2）在各种组织中均高水平稳定表达，说明甘蔗D家族基因组成型表达，行使甘蔗蔗糖合成的基本功能。在本研究中，SofSPSC和SofSPSA在甘蔗伸长期均表达较强；到了蔗糖积累前期，SofSPSC基因表达稍有降低，但仍处于较高水平，而SofSPSA基因表达加强，可使甘蔗蔗糖合成酶的活性仍处于较高水平；但到了甘蔗积累后期，SofSPSC和SofSPSA基因在成熟叶片中的表达明显下降，表明甘蔗此时蔗糖的合成需求下降，不需要太强的SPS活性。因此，甘蔗通过调控SPSC和SPSA基因的表达而调控蔗糖的合成强度。

本研究还表明，甘蔗SofSPSB基因在3个时期所有品种的成熟叶片中表达均极低，与用成熟叶与未成熟叶混合样品分析的结果相似（未发表结果）；但Grof等（2007）认为，甘蔗B家族SPS基因在未成熟叶和成熟叶中均高量表达。由于成熟叶片是甘蔗蔗糖积累的源头，因此推测SofSPSB基因不参与甘蔗源叶中蔗糖的合成而主要参与蔗糖的积累与利用。在本研究中，甘蔗各家族SPS基因在低、中、高糖品种的未成熟叶（心叶）、成熟叶（+2叶）及茎中的表达变化趋势一致，表明各家族SPS基因在不同蔗糖分甘蔗品种间的表达特性相似，与Grof等（2006）的研究结果一致，即甘蔗各家族SPS基因在高糖基因型（I-H2）和低糖基因型（I-L2）的叶片和节间的表达特性没有差异，因此认为SPS的活性是受转录后调控。但是，甘蔗各家族SPS基因具体的生物学功能仍需进一步通过过量表达和基因沉默等手段研究阐明。

4 结论

本研究结果表明，甘蔗通过D家族SPS基因维持甘蔗蔗糖合成的基本功能，通过调控C和A家族SPS基因的表达来调控蔗糖合成的强度，B家族基因不参与甘蔗源叶中蔗糖的合成而主要参与甘蔗蔗糖的积累与利用。

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（責任编辑 韦莉萍）