TLC—HPLC检测三黄连合剂的有效成分

杨剑 牛晓艺 黄明 梁万文 胡庭俊

摘要：【目的】以薄层色谱法—高效液相色谱法（TLC-HPLC）检测三黄连合剂的有效成分，为制定其质量标准及后期临床推广应用提供理论依据。【方法】采用TLC对三黄连合剂中的主要组分黄连、黄芩和连翘进行定性鉴别，并以HPLC对其主要有效成分黄芩苷、盐酸小檗碱和连翘苷进行含量测定。【结果】三黄连合剂TLC色谱中的图像斑点清晰，与标准品对照斑点对齐，颜色一致。HPLC测定三黄连合剂中黄芩苷、连翘苷和盐酸小檗碱分别在75.00～1200.00 μg/mL（r=0.9997）、4.17～66.67 μg/mL（r=0.9998）、9.38～150.00 μg/mL（r=0.9999）范围内线性关系良好，平均回收率分别为113.92%、100.18%和100.40%，其含量分别为5.03、0.25和0.27 mg/mL。【结论】TLC-HPLC可作为三黄连合剂的质量控制方法，且操作简便、重现性良好。

关键词： 三黄连合剂；有效成分；质量标准；薄层色谱法（TLC）；高效液相色谱法（HPLC）

中图分类号： S853.73 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）02-0312-07

0 引言

【研究意义】中药复方制剂的安全、有效、质量可控是其质量标准研究与制定的主要目的之一，但中药复方制剂成分复杂，主要成分鉴别与含量测定是其质量标准的关键，也可为后期的药理药效学研究提供基础资料。因此，开展中药复方制剂主要成分的鉴别与含量测定，实现其质量可控的目的，对进一步阐明其作用机制及安全性和有效性具有重要意义。【前人研究进展】近年来，中药复方制剂成分的鉴别、测定与分析多采用薄层色谱法（Thin layer chromatography，TLC）、高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）等。蒲晓辉等（2007）采用TLC-HPLC分别建立了肝宁颗粒中川芎的鉴别与阿魏酸（FA）含量测定的方法。随后，葛建华等（2009）采用HPLC建立了快速、简便、准确测定茵陈蒿汤中绿原酸和栀子苷含量的方法；谢薇等（2010）针对肝康颗粒中黄芪等成分进行TLC鉴别，同时对大黄素等进行HPLC含量测定；王静等（2011）同时对芪参益气滴丸中迷迭香酸等5个丹参活性成分含量进行分析，建立了准确、重复性好的HPLC和超高效液相色谱法（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）；刘必旺等（2011）成功建立了HPLC和TLC测定复方葛根胶囊中葛根素含量的方法；陈鹏等（2014）分别采用HPLC和TLC对藏药十味消食散中桂皮醛、胡椒碱进行定性鉴别及含量测定，成功建立了藏药十味消食散的质量控制方法；Fu等（2015）采用TLC和HPLC分别鉴定了山楂颗粒中大黄酚等3种生物活性物质；于燕莉等（2015）建立HPLC测定复方葛根片中延胡索乙素含量的方法。国外也有不少学者对中药及其复方制剂的主要成分进行鉴定、检测与分析，Gnoatto等（2005）首次采用HPLC-UV对巴拉圭茶水提物中总皂苷进行检测，并发现该方法可用于其他中药三萜式皂苷的检测；Pandith等（2013）成功采用HPLC对香泽兰叶子提取物中的有效活性成分——黄芩素甲基醚进行鉴定、测定及分析。【本研究切入点】三黄连合剂是广西大学动物科学技术学院兽医药理实验室自主研制的中兽药复方制剂，其组成药物为黄芩、黄连、连翘等，具有抗菌消炎的作用，主要用于罗非鱼链球菌病治疗，但目前尚无相应的质量标准。【拟解决的关键问题】以针对三黄连合剂建立的TLC定性鉴别方法对处方中的主要组分（黄连、黄芩和连翘）进行定性鉴别，并建立HPLC测定该复方中主要有效成分（黄芩苷、连翘苷和盐酸小檗碱）的含量，以期为制定其质量标准及后期临床推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

三黄连合剂由广西大学动物科学技术学院委托广西某兽药公司生产（批号20130629、20130702和20130705）；连翘苷对照品（批号110821-201112）、盐酸小檗碱标准品（批号110713-201212）和黄芩苷标准品（批号110715-201117）购自中国食品药品检定研究院。黄连对照药材、连翘对照药材、黄芩对照药材由广西兽药监察所提供；乙腈（TEDIA）、磷酸（Fisher）为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：Waters 2695分离单元、Waters 2998二极管阵列检测器（美国Waters公司），Empower色谱工作站，硅胶H板（100 mm×100 mm，青岛海洋化工厂分厂）和硅胶G板（100 mm×100 mm，青岛海洋化工厂分厂）。

1. 2 主要组分的TLC鉴别

1. 2. 1 供试品溶液制备 分别取3个批次的三黄连合剂10.0 mL，蒸发浓缩至1.0 mL，后加入9.0 mL甲醇，通过无水中性氧化铝过滤除杂后，作供试品溶液备用。

1. 2. 2 黄芩定性鉴别 取黄芩对照药材1.0 g，加醋酸乙酯—甲醇（3∶1）混合溶液30.0 mL，加热回流30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇5.0 mL溶解，上清液即为黄芩对照药材溶液。取黄芩苷对照品0.500 mg，加入甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，即为黄芩苷对照品溶液。然后参照《中国兽药典（二部）》中的TLC，分别吸取供试品溶液3.0 μL、黄芩对照药材溶液4.0 μL和黄芩苷对照品溶液4.0 μL，点于同一硅胶H板上，以乙酸乙酯—丁酮—甲酸—水（5∶3∶1∶1）为展开剂展开，约40 min后取出晾干，喷2%三氯化铁乙醇显色。

1. 2. 3 连翘定性鉴别 取连翘对照药材，加石油醚20.0 mL，密塞，超聲处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5.0 mL溶解，即为连翘对照药材溶液。取连翘苷对照品0.500 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，即为连翘苷对照品溶液。然后参照《中国兽药典（二部）》中的TLC，分别吸取供试品溶液3.0 μL、连翘对照药材溶液5.0 μL和连翘苷对照品溶液3.0 μL，点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷—甲醇（8∶1）为展开剂展开，约40 min后取出晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃下加热至斑点显色清晰。

1. 2. 4 黄连定性鉴别 取黄连对照药材，加甲醇25.0 mL，超声处理30 min，滤过，即为黄连对照药材溶液。取黄连小檗碱标准品0.500 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，即为盐酸小檗碱对照品溶液。然后参照《中国兽药典（二部）》中的TLC，分别吸取供试品溶液2.0 μL、黄连对照药材溶液及盐酸小檗碱对照品溶液各3.0 μL，点于同一硅胶H板上，以苯—乙酸乙酯—甲醇—异丙醇—浓氨试剂（6.0∶3.0∶1.5∶1.5∶0.5）为展开剂，置于以浓氨试剂预饱和20 min的展开缸内展开，约30 min后取出晾干，置于紫外灯（365 nm）下检视。

1. 3 主要有效成分的HPLC测定

1. 3. 1 对照品溶液制备 精密称取22.5 mg盐酸小檗碱标准品，适量甲醇溶解并定容至50.0 mL，即为450.0 μg/mL盐酸小檗碱标准品储备液。精密称取10.0 mg连翘苷标准品，适量甲醇溶解并定容至50.0 mL，即为200.0 μg/mL连翘苷标准品储备液。精密称取36.0 mg黄芩苷标准品，适量甲醇溶解并定容至10.0 mL，即为3.6 mg/mL黄芩苷标准品储备液。将以上3种标准品储备液等量混合，即获得含黄芩苷1.2 mg/mL、连翘苷66.7 μg/mL和盐酸小檗碱150.0 μg/mL的混合标准品储备液。

1. 3. 2 样品溶液制备 任取三黄连合剂5.0 mL，甲醇定容至50.0 mL，即制成样品溶液。按照三黄连合剂的制备方法分别配制缺少黄芩、黄连、连翘的阴性对照药品。取阴性对照药品5.0 mL，甲醇定容至50.0 mL，即为阴性对照样品溶液。

1. 3. 3 色谱条件 色谱柱：Phenomenex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；洗脱方式：等度洗脱；流动相：0.4%磷酸（A）∶乙腈（B）=75∶25；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：277 nm；柱温：30 ℃；检测时间：25 min。

2 结果与分析

2. 1 三黄连合剂中3种主要组分的定性鉴别结果

2. 1. 1 黄芩定性鉴别结果 如图1所示，三黄连合剂供试品TLC色谱中的图像斑点清晰，供试品斑点与黄芩标准品斑点对齐，颜色一致，显示相同的斑点。

2. 1. 2 连翘定性鉴别结果 如图2所示，三黄连合剂供试品TLC色谱中的图像斑点清晰，供试品斑点与连翘标准品斑点对齐，颜色一致，显示相同的斑点。

2. 1. 3 黄连定性鉴别结果 如图3所示，三黄连合剂供试品TLC色谱中的图像斑点清晰，供试品斑点与黄连标准品斑点对齐，颜色一致，显示相同的黄色斑点。

2. 2 三黄连合剂中黄芩苷、盐酸小檗碱和连翘苷的含量测定结果

2. 2. 1 线性关系考察 分别取混合标准品储备液及不同浓度的混合标准品溶液各10.0 μL，按照1.3.3的色谱条件进行进样测定，记录不同浓度下各标准品的峰面积。以对照品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，分别求得黄芩苷、盐酸小檗碱和连翘苷的回归方程、相关系数及线性范围，结果如表1所示。

3 讨论

近年来，在中兽药质量标准研究中TLC和HPLC因其快速、开放性、灵活性等特点而被广泛应用，如对黄连药材、饮片及中成药（康纯等，2000）、疏糖瘀胶囊（杨小月和申欣，2007）、黄连供试品溶液（刘占厚等，2012）中的黄连进行TLC鉴定，也有对连翘原料药进行TLC鉴定（张贞丽等，2007；钟永康，2007）。一些中药复方制剂如一清颗粒（陈巧华和林期重，2004）、更年宁心胶囊（周颂东，2009）、止咳化痰丸（孙景等，2014）中黄芩的TLC鉴别也相继被报道。同时，有学者建立了检测不同中药复方制剂中黄芩苷、连翘苷、盐酸小檗碱含量的HPLC测定方法，其中有单独检测蒲地蓝消炎片中黄芩苷（邵礼梅等，2012）、清热化毒丸中黄芩苷（刘汇等，2013）及胜红清热片中连翘苷（曾嵘等，2006）、柴连口服液中连翘苷（李锐和陈国彪，2010）；也有同时测定安宫牛黄丸中黄芩苷、盐酸小檗碱和栀子苷（韩凤梅等，2007），十味龙胆花颗粒中盐酸小檗碱和龙胆苦苷（徐远金等，2007），双黄消炎片中黄芩苷和盐酸小檗碱（许国兵和刘志武，2008），大卫颗粒中黄芩苷和连翘苷（姚帅等，2012），二妙丸中盐酸小檗碱和黄柏碱（张莉和潘超，2011）的研究报道。上述研究结果均表明，以TLC和HPLC检测中兽药及其合剂有效成分具有准确可靠、重复性好等特点，可用于中兽药质量控制。

三黄连合剂药味多、成分复杂，其主要有效成分的紫外吸收差异很明显，通过二极管阵列检测器全波长扫描，得知黄芩苷在214.4、277.0和315.1 nm处有最大吸收值，连翘苷在228.5和277.0 nm处有最大吸收值，盐酸小檗碱在228.5、264.0和346.1 nm处有最大吸收值。由于样品中连翘苷含量相对较少，因此在HPLC定量分析时选取277.0 nm波长。此外，本研究通过参考前人（张成志，2008；石瑶等，2009；刘阿静等，2012）的相关研究结果，分别采用乙腈—水、乙腈—磷酸溶液体系等作为流动相，以不同体积比进样测量，结果发现以乙腈-0.4%磷酸（25∶75）作为流动相的峰型更优，分离效果良好（R>1.5%），洗脱时间最短。

安全、有效、质量可控是对药品生产的基本要求，而质量标准研究是药品质量可控的必需过程。本研究采用TLC-HPLC聯用的方法对三黄连合剂进行定性定量分析，结果表明，经TLC鉴别获得的药材薄层色谱图斑点清晰，与标准品斑点对齐，颜色一致，说明3个批次三黄连合剂中均含有黄芩、黄连和连翘，即这3味中药的TLC色谱鉴别可作为制定该中药合剂质量标准的依据；采用HPLC对三黄连合剂的主要有效成分黄芩苷、盐酸小檗碱和连翘苷进行定量分析，结果表明该方法专属性强、灵敏度高、重复性好，可作为中药合剂的质量控制方法。可见，TLC-HPLC可作为对三黄连合剂鉴别及质量控制的检测方法。

4 结论

采用建立的TLC-HPLC可对三黄连合剂的主要组分黄芩、黄连和连翘进行定性鉴别及对黄芩苷、连翘苷和盐酸小檗碱进行含量测定，能较全面地反映出复方合剂的质量，操作简便、重现性良好，可作为三黄连合剂的质量控制方法。

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（责任编辑 兰宗宝）