活血健腰汤对大鼠退变椎间盘TNF-a表达的影响

●谢宏赞 张旭桥 仇湘中 蒋盛昶 张信成

活血健腰汤对大鼠退变椎间盘TNF-a表达的影响

●谢宏赞 张旭桥 仇湘中 蒋盛昶 张信成

目的：观察活血健腰汤对腰椎间盘退变大鼠髓核组织肿瘤坏死因子-a(TNF-a)表达的干预作用，探讨活血健腰汤防治腰椎间盘退变的疗效机制。方法:40只10月龄SD大鼠随机分为造模组30只、假手术组10只；采用纤维环穿刺法建立椎间盘退变模型，造模组造模成功后随机分为模型组、活血健腰汤组、布洛芬组，每组各8只、造模成功给药20天后检测大鼠髓核组织TNF-a的表达水平。结果:模型组腰椎间盘髓核组织TNF-a表达较假手术组增高，差异均有非常显著性意义(P＜0.01)；活血健腰汤组腰椎间盘髓核组织TNF-a的含量均低于模型组，差异均有明显统计学意义(P＜0.01)；布洛芬组腰椎间盘髓核组织IL-1的含量低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:活血健腰汤可能是通过抑制大鼠退变腰椎间盘髓核组织中致炎因子TNF-a的表达来减轻腰椎间盘的退行性改变。

腰椎间盘退变；活血健腰汤；肿瘤坏死因子-a；大鼠

椎间盘退变是盘源性腰痛的病理机制，也是腰椎间盘突出症的病变基础，是临床非常常见的疾病。课题组先后采用自拟方活血健腰汤治疗腰椎间盘突出症微创术后残余症状均获得满意疗效[1-2]，为进一步探索其治疗机理，课题组特开展活血健腰汤对大鼠退变椎间盘NF-a表达的影响的研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

①动物健康SD大鼠40只，雌雄兼用，体质量250～300g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(湘)2015-0027。

②药物活血健腰汤处方来源于湖南省中医药研究院附属医院骨伤科，药物组成：当归15g、川芎12g、赤芍15g、熟地25g、活血藤15g、元胡10g、续断12g、蜈蚣1条、全蝎3g、甘草5g，药物均购于湖南省中医药研究院附属医院，常规煎煮，冰箱内冷藏48h，将冷藏液离心，上清液滤过，得混悬药液浓度为含生药21.6g/10mL，5℃保存备用。阳性对照药物布洛芬，由中美史克公司生产，规格为每粒0.3g，配制成含生药10.7mg/10mL 混悬液，批号：20150702，国药准字H10900089。

③主要试剂青霉素钠注射剂：80万U/支，华北制药股份有限公司，批号：F2503426。0.9%氯化钠注射液：国药集团容生制药有限公司，批号：1207301-031。灭菌注射用水：国药集团容生制药有限公司，批号：1204514-B11。

④主要仪器HM335E型切片机，德国MICROM公司；AP280-123型包埋机，德国MICROM公司；Eclipse.E2OO型光学显微镜，日本Nikon公司；透射电子显微镜JEM-1230型，日本电子公司；微型高速离心机，上海安亭科学仪器设备厂；MultiskanMK3 型酶标检测仪，芬兰雷勃公司；解剖显微镜：K-400L麦克奥迪实业集团中国有限公司。

1.2 方法

①动物分组动物适应性饲养1周后，40只SD大鼠按随机数字表法分为造模组30只、假手术组10只。

②造模方法采用纤维环针刺法[3]复制动物模型。10%水合氯醛(3mL/ kg）腹膜内麻醉，剪毛、左侧卧位固定大鼠、消毒、铺无菌巾。取右腹后外侧正中切口长约2cm，腹外斜肌与背肌之间剪开，腹膜外入路到达椎体右侧方，依据髂嵴定位(平L6椎体)，暴露L3-4、L4-5、L5-6 椎间隙，用16G穿刺针头，由椎间盘纤维环前外侧方平行终板，与脊柱矢状面呈约450角方向刺入L4-5，深度控制在2.3mm,行全层针刺，维持10s后拔针,术毕逐层缝合创口。假手术对照组：仅切开皮肤后缝合。并连续3d各组大鼠均腹腔注射青霉素钠盐20 万U/kg，每天1 次，以预防切口感染。术后各组大鼠在23～25℃环境中，同等正常条件下单笼标准饲料喂养20天。

③给药方法造模成功单笼常规饲养20天后，开始灌胃给药，中西药服药剂量按成人体质量70kg等剂量计算大鼠用药剂量。活血健腰汤组：灌胃体积10mL/kg， 给药剂量为3.9 g/（kg·d），连续20天；布洛芬组：灌胃体积10 mL/kg，给药剂量为0.1 g/（kg·d），连续20天；模型组及假手术组则每日灌予同等量饮用水，连续20天。两种药物的总量均分早、晚两次灌服。

④标本收集给药20天，末次给药后12h，所有大鼠均采用腹腔注射过量10%水合氯醛麻醉处死大鼠，沿上、下软骨终板与椎体的交界面完整切取大鼠L4-5椎间盘，置于-80℃冰箱保存待测。

⑤检测指标及方法造模手术20天后，治疗组、造模组、假手术和对照组各随机抽取2只大鼠进行电镜下椎间盘的超微结构观察；采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行TNF-α含量的测定，标本送长沙维尔生物科技有限公司检测。

⑥统计学方法使用SPSS19.0统计软件进行处理。计量资料采用“±s”表示，方差齐采用单因素方差分析，若方差不齐采用Tamhane＇s T2，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模过程中大鼠死亡情况造模期间死亡大鼠3只，其中假手术组1只，模型组2只。再采用随机数字表法将造模组造模成功大鼠24只分为模型组、活血健腰汤组、布洛芬组，每组各8只。

2.2 各组大鼠腰椎间盘髓核组织中TNF-α含量比较

活血健腰汤组、布洛芬组、模型组腰椎间盘髓核组织TNF-α的含量均高于假手术组，差异均有显著的统计学意义（P＜0.01）；活血健腰汤组腰椎间盘髓核组织TNF-α的含量均低于模型组，差异均有显著的统计学意义（P＜0.01）。活血健腰汤腰椎间盘髓核组织TNF-α的含量与布洛芬组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1

表 1 实验 6 周后大鼠腰椎间盘髓核组织中TNF-α含量比较 （±s，ng/L）

表 1 实验 6 周后大鼠腰椎间盘髓核组织中TNF-α含量比较 （±s，ng/L）

注：与假手术组组比较 ＃P＜0.01；与模型组比较△P＜0.01。

组别数量TNF-α假手术组53.18±1.62模型组812.09±2.36#活血健腰汤组89.22±2.39#△布洛芬组810.79±2.54#

图1 假手术组喂药20天时镜下表现

图2 模型组喂药20天时镜下表现

图3 对照组20天时镜下表现

图4 活血健腰汤组20天时镜下表现

3 讨论

中医药治疗盘源性腰痛历史悠久、疗效确切，仇湘中教授根据其30多年临床经验提出：盘源性腰痛需从“肝虚血瘀”论治[4]，本研究采用的活血健腰汤取法于明朝医家张三锡所著《医学六要·治法汇》卷七之“补肝汤”（熟地、当归、川芎、芍药、木瓜、酸枣仁、甘草）：去“补肝汤”中酸枣仁、木瓜、改生地为熟地，并加活血藤、续断、蜈蚣、全蝎、元胡组成。“四物汤”为活血化瘀、补血柔肝的代表方，也是历代医家治疗血瘀的最常用的方剂之一，改白芍为赤芍后活血化瘀的功效更强；“补肝汤”功效为养血柔肝，活血调经。张三锡在《医学六要·治法汇》中对“补肝汤”主治功效记载如下：“主肝血不足，头目眩晕，少寐，月经量少，以及血不养筋，肢体麻木，小腿转筋”，其中“血不养筋，肢体麻木，小腿转筋”与腰椎间盘病变的症状体征极其相似，因此，课题组运用活血健腰汤治疗盘源性腰痛具有充足的理论依据。

“活血健腰汤”中当归活血化瘀、补肝柔肝为君药；熟地、芍药、活血藤、元胡、续断、甘草则补血柔肝、化瘀通络、缓急止痛，共为臣药；佐药川芎、蜈蚣、全蝎有加强活血通络止痛、助药力直达病所之功；甘草之调和诸药的功效则为使。全方共奏活血化瘀、柔肝缓急，通络止痛的作用，故用于临床治疗瘀血型腰椎间盘突出症取得了满意的疗效。肝为藏血之脏，血的代谢异常则导致肝失所养，故筋不得柔，发为腰腿挛急疼痛。方中熟地甘温味厚，而质柔润，长于滋阴养血。当归补血养肝，和血调经。赤芍活血养血、柔肝和营，川芎活血行气，调畅气血，活血藤功专活血。其中地、芍为阴柔之品，与辛温之归、芎相配，则补血而不滞血，和血而不伤血，四药有活血藤之助，活血化瘀之力更强，而在甘草、元胡、熟地的缓解反制之下，活血而不伤正。续断甘温补益，为平补肝肾之要药，又有活血通络之功效。蜈蚣辛温走窜，通经逐邪，有调达肝经通络止痛之功,为镇痛、散结之要药。全蝎味辛,能行风药直达病所,与蜈蚣配伍则通络止痛之效倍增。延胡索活血、理气、止痛。甘草缓急柔肝、补血调中、调和诸药，即可防止活血化瘀制品伤脾胃、又可缓急柔肝止肢体麻木，小腿转筋之症，还可调和诸药行使使药之功。综观全方，结构紧密、浑然一体，具有养血柔肝、活血化瘀、通络止痛之效，从而使腰部疼痛及患肢麻木疼痛诸症得以缓解。全方结构紧密、浑然一体，具有养血柔肝、活血化瘀、通络止痛之效，故用于临床治疗瘀血型腰椎间盘突出症取得了满意的疗效。现代药理研究证实，上方有抗炎、镇痛、免疫调节的作用。可降低毛细血管通透性，改善微循环，消除神经水肿及肌肉痉挛，增强人体抵抗力，缓解对神经根的化学及自然免疫刺激等作用[4]。

椎间盘退变是一个动态的复杂过程，引起退变的确切原因尚不清楚，研究发现椎间盘中的细胞因子在椎间盘退行性变的病理过程中发挥重要的作用，目前已知的细胞因子有100 多种，其中，IL-1、IL-6、TNF-α、NO 等被公认为是参与椎间盘退变的最重要的细胞因子[5]。研究显示：TNF-α与椎间盘退变关系密切[6]，有足够的证据表明它们均参与椎间盘退变的过程[7]。大量研究表明：TNF-α可促使血管生成诱导因子如血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶MMP-3、MMP-7 及血浆酶的产生，从而使蛋白多糖减少，椎间盘组织被吸收[8]。本研究通过动物实验发现，活血健腰汤能抑制腰椎间盘髓核组织中TNF-α的表达，说明活血健腰汤对于机体内细胞因子有调节作用，可抑制炎性物质的释放，也初步提示，活血健腰汤极有可能是通过抑制TNF-α的合成和分泌发挥其延缓椎间盘退变的作用。

（作者单位:谢宏赞 张旭桥:湘潭市中医医院；仇湘中 蒋盛昶 张信成：湖南省中医药研究院附属医院）

[1]张旭桥,姜升平,王晓晖,等.活血健腰汤对腰椎间盘突出症射频消融术后临床疗效的影响[J].中医临床研究,2014,6(2):17-20.

[2]张旭桥,姜升平,王晓晖,等. 活血健腰汤治疗腰椎间盘突出症微创术后残余症状1例[J]. 中国中医骨伤科杂志,2014,22(6):61-62.

[3]黄河,李宁宁,胡朝晖,等.纤维环穿刺法与腰椎失稳法建立椎间盘退变模型[J].中国现代医生,2011,49(16):22-24.

[4]仇湘中,蒋盛昶,张信成,等. 补肝健腰方对腰椎间盘退变大鼠髓核组织TNF-a.IL-1 }3干预作用的研究[J].湖南中医药大学学报,2015,35(4):17-23.

[5]李茂,彭宝淦.细胞因子在椎间盘退变中作用的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2012,20(21):1 960-1 962.

[6]樊国峰,刘创建,王丹,等.白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α与腰椎间盘退变的研究进展[J].河北医科大学学报,2008,29(4):624.

[7]石凤英,姜莉.灵芝对大鼠退变椎间盘中白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子α及一氧化氮含量影响的意义[J].中国临床康复,2006,10(19):56-58.

[8]刘阳,朱立新.细胞因子和炎性介质对腰椎间盘退变的作用[J].颈腰痛杂志,2010,31(1):57-58.

Study of the Intervention of Huoxue Jianyao Decoction on TNF-α of the Nucleus Pulposus in Rats with Lumbar Disc Degeneration

Xie-Hongzan Zhang-Xuqiao Qiu-Xiangzhong,et al

Objective The preventive effects of Huoxue Jianyao decoction on TNF-αexpressions in rats with lumbar spine degeneration were observed.The efficacy mechanization of the Huoxue Jianyao decoction in treatment of lumbar disc degeneration was explored. Methods 40 10-month-old SD rats were randomly divided into model group and the sham -operation group, with 30 and 10 respectively. The lumbar spine degeneration models were established by annulus puncture. After the successful modeling, the rats were randomly divided into model group, Huoxue Jianyao decoction group and ibuprofen group, with 8 in each group. The expression levels of TNF-α in nucleus pulposus of lumbar disc tissue were detected after six-month administration. Results The expression of TNF-α in nucleus pulposus of lumbar disc in the model group was increased compared with sham-operation group, and the differences were very significant (P＜0.01);the expression of TNF–α in nucleus pulposus of the lumbar disc in Huoxue Jianyao decoction group were lower than the model group, and the differences were statistically significant (P＜0.01); The level of IL -1β in the ibuprofen group was lower than the model group, and the difference was statistically significant (P＜0.05). Conclusion Huoxue Jianyao decoction can reduce degenerative changes in the lumbar intervertebral disc by inhibition TNF–α in nucleus pulposus of the lumbar disc of rats.

lumbar disc degeneration； Huoxue Jianyao decoction; TNF-α; rats

仇湘中

2011年度湖南省中医药科研计划项目（2011106），2016年湘潭市科技局立项项目（JZ20161035）