Pim-3蛋白在急性白血病中的表达及意义

●温乾辉许林林田祖国潘娟

Pim-3蛋白在急性白血病中的表达及意义

●温乾辉1许林林2田祖国1潘娟1

目的：探讨pim-3蛋白在急性白血病(AL)中的表达及意义。方法：采用免疫组化SP法检测30例急性髓细胞白血病(AML)和20例急性淋巴白血病(ALL)患者中pim-3蛋白的表达情况，同时选取15例非恶性血液病的患者作为对照，统计学分析各组间Pim-3蛋白的表达差异。结果：Pim-3蛋白在急性白血病患者中的表达阳性率显著低于非恶性血液病患者，但在急性髓细胞白血病患者中和急性淋巴白血病患者中无统计学差异；结论：Pim-3蛋白在急性白血病中的异常表达可能与白血病的发生、发展有关。

Pim-3蛋白；免疫组化；急性白血病；异常表达

急性白血病（AL）是造血干细胞的恶性克隆性疾病，细胞在骨髓

及其他造血组织中发生增殖失控、分化障碍和凋亡，停滞在生长发育的不同阶段，严重危害患者的健康，但其病因和发病机制尚不十分清楚，难治和复发一直是临床医生在白血病治疗过程中所面临的最为棘手的问题，由于白血病发病迅速、恶性程度高、预后较差及治疗费用高，严重地威胁着患者的生命和生活质量[1]。Pim-3是一个保守的蛋白激酶类原癌基因家族成员，其表达受众多生长因子和细胞因子的调控[2]。研究发现Pim-3在多种内胚层衍生来源的肿瘤，如肝癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌等组织中高表达。本研究旨在探讨Pim-3蛋白在急性白血病中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年12月一2016年2月期间在遵义医学院附属医院住院和门诊被确诊为急性白血病患者50例，其中急性髓细胞白血病30例，急性淋巴细胞白血病20例；选取15例非恶性血液病患者作为对照组，包含贫血、溶血、感染、血小板减少等疾病。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器

上海奥林巴斯光学显微镜(OLYMPUS BX53),光明电热恒温水箱( HHW21.420AII),上海精科电子天平(EA1204B),合肥美的电冰箱(BCD-195SM（Q）)。

1.2.2 试剂

兔抗人多克隆抗体Pim-3（bs-4528R）、免疫组化SP试剂盒（SP-0023）、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒（C-0010）均购自北京博奥森生物技术有限公司，苏木精购于贵阳恒因公司。

1.3 方法（免疫组化）

采用链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶（SP)法检测pim-3蛋白的表达。将每个标本用4%多聚甲醛固定20分钟，PBS（PH6.4—6.8）冲洗5次（每次清洗3分钟）；滴加3%的过氧化氢孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次（每次清洗3分钟）；滴加正常山羊血清工作液封闭，室温孵育20分钟，倾去，勿洗；滴加用PBS稀释100：1倍的兔抗人多克隆抗体pim-3，37℃孵育3小时,PBS冲洗3次（每次清洗3分钟）；滴加生物素标记山羊抗兔IgG，37℃孵育20分钟，PBS冲洗3次（每次清洗3分钟）；滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育20分钟，PBS冲洗3次（每次清洗3分钟）。滴加DAB显色剂显色，室温10分钟，自来水充分冲洗。加苏木素复染10分钟，PBS冲洗3次（每次清洗1分钟）至反蓝。

结果判定：采用半定量积分法判断结果[3]：总共计数200个粒细胞，按照阳性细胞所占比例及染色深浅进行结果判定：①按阳性细胞所占的比例来评分：≤5%为0分，6% ～25%为1分,26% ～50%为2分，50%～75%为3分,＞75%为4分；②按照细胞的染色深浅来评分：细胞无着色为0分，染成淡黄色为1分，染成黄色为2分，染成黄棕色3分；计算两项之和，判断染色强度：0～1分（—），2～3分（+），4～5分（++），≥6分（+++）。

1.4 统计学处理

免疫组化SP法测定的Pim-3蛋白表达阳性率组间比较采用x²检验，而分析各组间Pim-3蛋白表达强度的差异采用秩和检验,差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pim-3蛋白定位与判断

Pim-3蛋白阳性结果是定位于细胞质内，其被染成浅黄色至黄棕色，见图1。

图1 Pim-3蛋白在不同骨髓组织中的表达情况

2.2 免疫组化SP法检测 Pim-3蛋白水平结果

Pim-3蛋白在非恶性血液病及急性白血病（AL）患者中的阳性率分别为100%和78%，差异有统计学意义，具体见表1。急性髓细胞白血病（AML)和急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中的Pim-3蛋白的表达强度均显著低于非恶性血液病患者，而急性髓细胞白血病（AML）患者Pim-3蛋白表达强度与急性淋巴白血病（ALL）患者差异无统计学意义，具体见表2。

表1 pim-3蛋白在AL和非恶性血液病患者中的表达阳性率

在细胞质中，出现浅黄色或黄棕色为阳性反应。阴性（-）：无着色；弱阳性（+）：呈浅黄色；阳性（++）：呈黄色；强阳性（+++）：呈黄棕色。

表2 pim-3蛋白在非恶性血液病和AML与ALL患者中的表达强度

3 讨论

急性白血病（AL）为血液系统恶性疾病，起病急、进展快、自然病程短，若不经及时特殊有效治疗，大概只有3个月的生存时间，短者可能在诊断数天后即发生死亡。所以，对急性白血病的早发现、早诊断、早治疗显为十分重要，而进一步发现有针对性的白血病新特异性标志物很是迫切。而肿瘤特异性标志物的特点应该可以调控肿瘤细胞的过度增殖，并在其中起到了不可或缺作用，且在肿瘤组织的表达与正常组织中存在明显差异。

Pim激酶家族是与钙/钙调蛋白调节(CAMP)相关的原癌基因，有3个成员：Pim-1、Pim-2、Pim-3，它们都有一个共同的ATP锚活化位点，并在结构序例上有高度的相似性，且在大多数组织和细胞的进化过程中高度保守。目前尽管有大量的研究资料显示pim激酶的升高与抑制细胞的凋亡有显著的关系，但也有一些研究资料表明pim激酶对细胞的凋亡也有一定的促进作用。

Fujii等研究发现在人类组织中，Pim-3mRNA存在于心肌、骨骼肌、大脑、肾、肺、脾、胎盘和白细胞中，且在心肌和骨骼肌中高度表达[4]。研究显示，Pim家族中Pim-1、Pim-2在多种肿瘤组织中被证实均有异常的表达，李颖等人发现Pim-1mRNA在白血病表达显著增高，且急性淋巴细胞白血病患者组的pim-1mRNA表达高于急性髓细胞白血病和慢性髓细胞白血病患者组[5]。黄绿叶等发现急性淋巴细胞白血病患者初治和复发Pim-2的表达低于正常人，急性髓细胞白血病患者的Pim-2表达情况与正常人无明显差异[6]。而Pim-3蛋白在胃癌、食管鳞癌、心肌缺氧、胰腺癌等多种肿瘤细胞中均有异常表达[7]。

目前对于Pim激酶家族在急性白血病研究中的主要集中于Pim-1和Pim-2，而相对于Pim-3激酶在急性白血病中的研究要较少，周震沧等研究发现未经过化疗的急性髓细胞白血病中的Pim-3基因表达低于正常对照组，而经化疗治疗过的急性髓细胞白血病的Pim-3基因表达与正常对照组的Pim-3基因表达差异不明显[12]。本文实验SP法显示：Pim-3蛋白在急性白血病患者中表达的阳性率是低于非恶性血液病患者，急性髓细胞白血病及急性淋巴细胞白血病患者Pim-3蛋白的表达强度均低于非恶性血液病患者，急性髓细胞白血病与急性淋巴白血病患者Pim-3蛋白表达强度不存在明显差异，初步说明了Pim-3蛋白的下调对急性白血病的发生及发展中发挥了一定的作用。由于本研究病例数相对较少，论据不够充分，需要进一步加大标本量，长期监测Pim-3蛋白随白血病病程的变化并与临床相结合，从而更深入探讨pim-3在白血病中的作用。

本研究结果显示，急性白血病患者中的Pim-3蛋白表达阳性率及表达强度均低于非恶性血液病，而急性髓细胞白血病与急性淋巴白血病患者Pim-3蛋白表达无差异， 提示pim-3蛋白在急性白血病中的异常表达可能与该病的发生、发展有关。对于Pim-3蛋白表达的变化能否成为今后急性白血病有效的诊断及病情监测的指标，有待于后续的深入研究。

（作者单位：1遵义医学院附属医院检验科；2遵义市口腔医院）

[1]许文荣，谷俊侠．临床血液学检验[M]．南京：东南大学出版社，2001：207．

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田祖国，副主任医师

贵州省科学技术基金（项目编号：黔科合J字LKZ[2012]09）