1起家庭聚集性肺炎病原学检测及基因特征分析

许玉玲 王海霞 聂轶飞 罗成琳 黄学勇 赵 坤 许汴利

1起家庭聚集性肺炎病原学检测及基因特征分析

许玉玲 王海霞 聂轶飞 罗成琳 黄学勇 赵 坤 许汴利

目的 分离鉴定引起家庭聚集性肺炎的病原体，并进行基因特征分析。方法 采集该家庭每个成员的血清、咽拭子和肺炎患者的肺泡灌洗液，通过PCR方法、病毒分离、hexon测序、BLAST比对和血清IgG酶联免疫方法检测病原，并对hexon序列进行进化树分析。对阳性病毒分离物进行全基因组扩增。结果 父母咽拭子2份、孩子肺泡灌洗液2份经PCR检测均为腺病毒(AdV)阳性，肺泡灌洗液病毒分离阳性，4份标本hexon区域PCR扩增测序，核苷酸同源性为99.5%～100.0%，病毒全序扩增拼接分析，BLAST比对与腺病毒7型核苷酸同源性97.0%，基因进化树分析显示hexon基因分型与腺病毒7d位于同一分支。ELISA方法检测一家4口均出现恢复期与急性期血清腺病毒IgG4倍增高现象。结论 腺病毒7型是该起家庭聚集性肺炎的病因。

腺病毒7；大叶性肺炎；聚集性病例

近些年，多地大型综合性医院和综合性儿童医院发表有关儿童“大叶性肺炎”病例增多趋势的文献，试图从临床和病原等方面多角度剖析该病高发的原因。2002～2004年，台湾地区的儿童大叶性肺炎在肺炎中的比例从7%上升到了19%[1]；安徽省也有儿童大叶性肺炎比例从2008年的4.2%上升到2009年14.4%的报道[2]；河南省儿童医院及各综合医院儿科数据显示，近几年儿童大叶性肺炎患者数量增加，临床症状及治疗效果与以往均有变化，抗生素治疗效果不佳，肺部炎症消散较慢。为研究引起儿童大叶性肺炎病原学构成，为临床诊断和治疗提供更科学的依据，本单位与河南省中医学院儿科建立合作关系。现将一起家庭聚集性肺炎的检测方法和结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例与标本采集 2010年12月10日该院儿科收一3岁患儿，以“咳嗽1周，加重伴发热4d”入院，入院查体：体温40℃，脉搏140次/min，呼吸38次/min，呼吸音粗，消化系统和循环系统无异常，精神状态欠佳。血常规检测：白细胞总数6.62×109/L，胸部CT检查：右上肺有渗出，右侧显示有胸腔积液。患儿父母告知，自行抗生素治疗4d，未见好转。该患儿姐姐7岁，于11月中旬出现咳嗽、流涕、低热等上呼吸道症状，抗生素治疗10d不愈，2周后逐步发展为左侧大叶性肺炎入院治疗，给予甲泼尼龙、头孢和痰热清针输液治疗5d，症状逐步缓解。其母亲出现呼吸道感染症状，父亲无明显症状。为明确病因，采集家庭成员相关标本进行病原学检测。

1.2 主要试剂和仪器 核酸提取试剂为Qiagen Elute（Cat：52904），呼吸道多病原检测试剂盒为江苏合创科技有限公司生产，该试剂盒采用四通道实时荧光PCR方法，检测15种呼吸道病毒：腺病毒（AdV）、合胞病毒(RSV)、鼻病毒(Rhino)、甲型流感病毒通用（Flu A）、乙型流感病毒（Flu B）、冠状病毒（229E+HKU1；NL63+OC43）、甲3型流感、博卡病毒、偏肺病毒（hMPV）、副流感病毒I～iv型（hPIVI～iv型）、新H1N1型。PCR扩增试剂为Taraka公司ExTaq酶试剂盒。细胞培养基为日本日水MEM粉剂，青链霉素、0.25%胰酶、谷氨酰胺均为Hyclone公司生产，腺病毒IgG检测试剂盒为赛润维润公司。荧光PCR仪器为BIO-RAD IQ5。

1.3 标本核酸提取与荧光RT-PCR检测 对肺泡灌洗液、咽拭子进行震荡、离心，提取上清液，按照核酸提取试剂盒说明书操作，提取各类标本核酸，-20℃保存，为后期试验准备。

呼吸道多种病原检测反应体系为各组分17.22μL，酶混合液0.8μL，样品核酸2.0μL，总体积共20μL，反应条件：逆转录阶段42℃10min，预变性阶段94℃，10sec，预扩增94℃，5s，50℃，20sec，72℃，20sec，5个循环，检测阶段：94℃，5sec，56℃，50sec，72℃，15sec，共40个循环，在检测阶段延伸处收集信号。观察扩增曲线和Ct值，记录阳性结果。

1.4 病毒分离 采用Hep2、Hela细胞进行病毒分离。将肺泡灌洗液和咽拭子经震荡、离心前处理后，取200μL接种单层细胞，每个标本2孔，36度培养5～7d，将第1代培养产物冻融2次后，离心，取上清200μL接种单层细胞继续二代培养，3～5d出现细胞变圆、皱缩或脱落等CPE现象，即可收获病毒，并用试剂盒提取核酸保存备用。

1.5 引物设计与腺病毒hexon基因PCR扩增 依据呼吸道病原实时荧光PCR结果判断分离病毒为腺病毒，设计合成腺病毒hexon引物ZY-1：GCTTTGAAAATGAGACACC，ZY-2：TAAGGTCCAAAGGTCCATCC，进行PCR扩增，扩增条件：94℃，5min；94℃，1min，54℃，45s，72℃，50s，35个循环，72℃，10min；电泳条件：琼脂糖凝胶浓度1.2%，电泳液1×TAE，电压6V/cm，30min，于BIO-RAD凝胶成像仪观察成像，并保存。

1.6 酶联免疫法检测腺病毒IgG 按照腺病毒IgG试剂盒说明书进行操作，将急性期血清稀释1∶2000倍，恢复期血清稀释1∶8000倍，经加样、孵育、洗板、显色等过程后，于酶标仪上检测各标本OD值，结合说明书判读结果。

1.7 生物信息学分析 将PCR产物委托南京金斯瑞公司进行测序，测序结果使用生物学软件ATGC进行拼接，在genebank上进行BLAST，获得比对结果。从网上下载腺病毒7型不同亚型代表株hexon基因14株，mega4.0分析其基因高变区（参考株Gomen的hexon基因403～1356bp）[3-4]核苷酸同源性分析，并绘制基因进化树。

2 结果

2.1 标本采集情况 收集到医院对肺炎患儿肺部灌洗液2份，一家4人每人咽拭子、急性期血清和恢复期血清各1份，共14份标本。

2.2 荧光RT-PCR结果 咽拭子、肺泡灌洗液和血清标本15种呼吸道病毒实时荧光PCR检测结果。见表1。

表1 各类标本实时荧光PCR检测结果

2.3 病毒分离鉴定结果 2份肺泡灌洗液在Hep2细胞1代接种第4天均出现明显CPE现象，其余标本无阳性结果。实时荧光检测腺病毒阳性的4份标本经hexon基因PCR扩增后，在850bp处均有亮带，对测序结果进行拼接分析，核苷酸同源性为99.5%～100.0%，网上BLAST比对显示与腺病毒7型核苷酸同源性为99%。分离病毒经全序扩增，测序、拼接，网上BLAST比对显示与腺病毒7型核苷酸同源性达97.0%。

2.4 hexon进化树分析 分离获得2株病毒，两株病毒hexon区核苷酸同源性99%，河南分离株hexon高变区与其余腺病毒7型各种亚型之间的核苷酸同源性为97.2%～100%，与7a、7d、7d2、7l亚型分离株的同源性均为100%，与1954年美国分离的Gomen原型株7p差异最大为2.8%，进化树分为2支，河南分离株与2010年中国分离株、2011年台湾分离株处于同一簇，距离HADV 7d最近。见图1。

图1 于hexon基因的腺病毒进化树分析注：“●”, henan adenovirus strain

2.5 血清腺病毒IgG结果 腺病毒阳性对照OD平均值为1.455，依据说明书计算出OD值＞0.733为腺病毒IgG阳性。父母孩子急性期血清IgG OD值分别为0.355、0.131、0.207、0353，均为阴性，而恢复期血清OD值分别为0.800、0.928、1.438、2.379，均为阳性，说明一家4人腺病毒IgG水平均出现恢复期比急性期4倍增高。

3 讨论

腺病毒可引起多种疾病，急性呼吸道感染、肺炎、角结膜炎、胃肠炎、脑膜脑炎、急性出血性膀胱炎等等[5]，不同的血清型与不同的疾病谱相关。腺病毒型别众多，目前已鉴定的血清型有57种，分属于A～G 7个不同的亚组，与呼吸道感染有关的是B、C、E组，尤其B亚组可引起严重的呼吸道疾病。腺病毒7型属于B亚组，可引起暴发流行，特别是在婴幼儿中可引起严重的支气管炎甚至是致命的肺炎[6]。世界多地均有腺病毒7型引起的呼吸道疾病报导，我国山西近年出现由腺病毒7型引起的70例婴幼儿下呼吸道感染暴发疫情，1例死亡[7]；美国在上世纪90年底末期，由腺病毒7型引起的呼吸道感染疾病占总腺病毒引起疾病的20%，所致疾病有轻型的上呼吸道感染，也有严重的肺炎等；韩国、日本、台湾、瑞士等多地均有腺病毒7型病毒致不同疾病的相关报导。

本研究一个家庭4人均感染腺病毒7型，父亲无任何症状，仅在双份血清中查出腺病毒IgG四倍增高，母亲则出现轻微上呼吸道感染症状，有咳嗽、咽痛等。两个孩子均出现发热、咳嗽及单侧肺叶炎症，抗生素治疗效果差，肺部炎症消散慢。上述情况说明人群对腺病毒普遍易感，因婴幼儿免疫系统发育不完善，抵抗力较低，感染腺病毒后易导致严重下呼吸道感染疾患，如支气管炎和肺炎等，而且肺炎感染后期会出现细菌合并感染现象。故早期诊断，明确病原，针对病因及时治疗比单纯对症用药效果显著。

检测呼吸道感染疾病的标本有鼻、咽拭子、痰液和下呼吸道标本等，鼻/咽拭子为开放性标本，所含病原比较丰富，在机体免疫力正常时，能与机体和谐共存，当机体免疫力降低，可致机体发病；肺泡灌洗液为下呼吸道深部标本，检测到的病原很可能就是患者的致病原因。本研究两个孩子肺泡灌洗液中均检测出腺病毒阳性，而咽拭子仅检测到其他病毒，父母咽拭子检测到腺病毒及其他病毒的混合感染，这些数据表明呼吸道疾病病原多种，仅检测咽拭子不能明确病因，即使检测呼吸道深部标本某种病原阳性，仍需与该患者双份血清该病原IgG四倍增高结合，才能明确病因。

既往腺病毒7分型依据不同的限制性内切酶图谱，可分为7a～7l，7p等10多种亚型，近年来依据基因序列进行进化树分析型别，因其快速准确已被广泛应用。不同国家不同时间有不同亚型占主导地位，毒株在不同国家之间传播与循环。1966～2000年，美国分离腺病毒7型以7b型为主，占65%，7d2占28%，1998～2000年出现7h，仅占2%，1996年日本上呼吸道感染标本分离腺病毒7型以7h为主[8]，韩国2005～2006年以7d流行占主导地位[9]，自1980年以来，我国腺病毒流行株为7d，山西省自2009年以来分离的腺病毒以7d为主，本研究分离腺病毒hexon基因遗传进化树分析与7d分离株亲缘关系最近。不同的亚型株是否与所致疾病轻重有关，还需要更多的临床资料与进一步的实验数据去验证。

明确腺病毒7型为该起家庭聚集性大叶性肺炎的致病原，提示了腺病毒7型在河南流行的可能性，为河南省儿童大叶性肺炎寻找流行病原提供实验室依据。

[1] Lin CJ,Chen PY,Huang FL,et al.Radiographic,clinical and prognostic features of complicated and uncomplicated community-acquired lobar pneumonia in children[J].J Microbiol Immunol Infect,2006,39(6): 489-495.

[2] 侯舒,许晓燕,王亚亭,等.儿童大叶性肺炎危险因素分析[J].临床肺科杂志,2011,16(5):701-702.

[3] Erdman DD,Xu Wh,Su L,et al.Molecular epidemiology of adenovirus type 7 in the United States,1966-2000[J].Emerg Infect Dis,2002,8(3):269-277.

[4] 黄学勇，王海霞，许玉玲，等.腺病毒7型河南分离株全基因序列测定及基因重组分析[J].中国病原生物学杂志，2014,9（9）：804-807.

[5] Jones M,Harrach B,Ganac RD,et al.New adenovirus species found in a patient presenting with gastroenteritis[J].J virol,2007,81(11): 5978-5984.

[6] Kim Y,Hong J,Lee H,et al.Genome type analysis of adenovirus type 3 and 7 isolated during successive outbreaks of lower respiratory tract infectious in children[J].J Clin Microbiol,2003,41:4594-4599.

[7] Tang LY,Wang L,Tan XJ,et al.Adenovirus serotype 7 associated with a severe lower respiratory tract disease outbreak in infants in shanxi Province,China[J].Virol J,2011,8(23):1-7.

[8] Hashido M,Mukouyama A,Sakae K,et al.Molecular and serological characterization of adenovirus genome type 7h isolated in Japan[J]. Epidemiol Infect,1999,122:281-286.

[9] Lee WJ,Kang C,Chung YS,et al.Molecular classification of human adenovirus type 7 isolated from acute respiratory disease outbreak in Korea,2005-2006[J].Public health Res Perspect,2010,1(1):10-16.

Objective To isolate and identify the pathogen leading to a family gathered pneumonia and analyze its gene characteristics. Methods Collect everyone’s serum (acute and recovery stage), throat swab and bronchoalveolar lavage fluid of the family. The etiology was identified by PCR, virus isolation, hexon gene sequenced, BLAST and ELISA. The whole genome of the virus were further amplified and sequenced. Results 2 virus were obtained by Hep2 cell from 2 bronchoalveolar lavage fluids. Adenovirus was detected positive by PCR in parent 2 throat swabs and 2 children bronchoalveolar lavage fluids and 2 isolates. The nucleotide acid homologies of the 4 samples hexon genes were 99.5%-100%. The virus was finally identified as adenovirus 7 by 97.0% homology of nucleotide through BLSAT in the genebank. It was localized into the same cluster with AdV7d stains based on hexon gene using Mega 4.0. The level of adenovirus IgG in the recovery stage serum was 4 times higher than in the acute stage serum through ELISA in the 4 persons. Conclusion Adenovirus serotype 7 was the primary pathogen induced the family gathered pheunomia.

Adenovirus type 7; Lobar pneumonia; Gathered cases

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.26.003

河南省医学科技攻关重大项目（132102310060）

河南 450016 河南省疾病预防控制中心 （许玉玲 王海霞聂轶飞 黄学勇 许汴利） 450002 郑州大学附属郑州中心医院 （罗成琳）450008 河南中医学院一附院（赵坤）

许汴利 E-mail：xubl@hncdc.com.cn