羊种布氏杆菌3型Omp25基因序列及其表达蛋白生物信息学分析

贺容+张生珍+王超+刁正鹏+薛红梅+徐立青+李增魁

摘要：为进一步研究外膜蛋白Omp25的结构和功能，以羊种布氏杆菌3型青海省海晏县自然株为研究对象，通过基因的克隆测序，采用生物信息学方法对外膜蛋白Omp25基因及其编码的氨基酸序列的理化性质、分子结构、分子表面可能性、柔韧性、亲水性、抗原指数、B细胞抗原表位进行了详细分析。结果显示：羊种布氏杆菌3型Omp25分子一级结构的氨基酸序列的各项参数存在5段共同区段，其中59～74、93～112、182～202位氨基酸的各项生物信息学参数尤为突出，是其B细胞表位优势区的可能性很大。

关键词：羊种布氏杆菌3型；Omp25基因；序列测定；生物信息学分析

中图分类号：S855.99

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0025-03

羊布氏杆菌病是由布氏杆菌（Brucella）引起的一种人畜共患传染病，该病在全球范围内流行[1]，临床特征为慢性疲劳、波浪热、生殖系统损坏及全身性疾病[2]。青海省是人、畜见布氏杆菌病的高发区，1954年青海省首次分离出布氏杆菌，到2000年省内布氏杆菌病得到有效控制，并且达到国家颁布的布氏杆菌病“控制区”标准[3]，但是2006年该病疫情呈回升状态[4]。虽然目前针对该病的疫苗已经存在，但是由于疫苗使用不当造成布氏杆菌感染家畜或人的事件时有发生[5]，可见其保护率、安全性均很低。

布氏杆菌外膜蛋白（outer membrane proteins）Omp25/Omp31家族免疫原性强，可诱导免疫动物产生高滴度特异性抗体，纯化蛋白可用于布鲁菌病的诊断[6]。由于布氏杆菌的外膜蛋白（OMPs）暴露于S菌的表面，不仅能与IgG抗体发生反应，而且还可以引起保护性免疫反应，一直被作为研究的重点[7]。本研究采用羊种布氏杆菌3型青海省海晏县自然野毒株，对其外膜蛋白Omp25基因进行克隆，用生物信息学方法对Omp25基因及其蛋白结构进行了分析和预测，避免试验的盲目性，为大量制备重组Omp25蛋白及其免疫原性及布氏杆菌多表位疫苗的设计奠定了基础，还可通过试验进一步对比验证其生物学活性，也为布氏杆菌病的诊断、用药及疫苗研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

羊种布氏杆菌3型23号[8]由青海省地方病预防控制所徐立青老师惠赠。

1.2 细菌的培养及基因组DNA的提取

将布氏杆菌23号划线于肝浸液固体培养基，生长24 h。挑单个菌落置于肝浸液液体培养基，于37 ℃、200 r/min振荡培养48 h，取3 mL菌液置于2个1.5 mL无菌离心管中，80 ℃ 水浴30 min，将灭活菌液按照细菌DNA提取试剂盒说明操作，分装后于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 引物合成

参考GenBank基因编码区序列，结合克隆载体pMD19-T的阅读框，应用Primer 5.0设计羊布氏杆菌Omp25基因PCR引物，预计其扩增目的片段长度为640 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体信息见表1。

1.4 Omp25基因的PCR扩增

PCR反应体系为25 μL，其中模板1 μL，浓度为 10 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，2×Taq PCR Master Mix（含染料） 12.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性 5 min；94 ℃45 s，55 ℃ 50 s，72 ℃1 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。反应完毕后，取10 μL反应液在1%琼脂糖凝胶中电泳，检查扩增结果。

1.5 Omp25基因克隆载体的构建

Omp25基因PCR产物经胶回收试剂盒回收后与pMD19-T载体于16 ℃连接3 h，连接体系为：0.5 μL pMD19-T载体，2 μL Omp25基因PCR产物，2.5 μL SolutionⅠ。取5 μL连接产物，转化100 μL的DH5α感受态细胞，将转化菌均匀涂布于含异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、X-gal的LB氨苄青霉素（Amp，100 μg/mL）固体培养基上；次日挑白色菌落，接种于3 mL含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37 ℃、200 r/min 振荡培养14 h，按照质粒小量提抽试剂盒说明提取质粒；用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，挑取阳性克隆，送上海华大基因科技有限公司测序。阳性克隆命名为 pMD19-T-Omp25。

1.6 Omp25基因抗原表位预测

综合利用DNAman、ProtParam、DANStar、SOPMA、SWISS-MODEL、BepiPred 生物学软件系统对Omp25分子的立体结构、分子的亲水性、表面可能性、柔韧性及免疫学特性进行分析。

2 结果与分析

2.1 Omp25基因扩增结果及克隆后双酶切鉴定结果

Omp25基因扩增片段及克隆后双酶切鉴定结果均与预计长度相符，详见图1。

2.2 Omp25基因的核苷酸序列及其编码的蛋白氨基酸序列

经测序显示，Omp25基因核苷酸序列长为640 bp，共编码213个氨基酸，详见图2。

2.3 Omp25蛋白分子抗原表位预测结果

利用生物学软件DNAstar、ExPASy服务器的ProtParam分析羊Ⅲ型布氏杆菌外膜蛋白Omp25分子的理化性质，详见表2。

通过NPS@IBCP服务器的SOPMA预测Omp25的二级结构，详见图3。可见其α-螺旋占24.88%，β-转角占 13.15%，无规卷曲占37.07%，延伸链占24.88%，总体来看该蛋白的卷曲程度较高，因此成为B细胞表位可能性大。