油茶籽壳总黄酮对黄曲霉毒素B1致肝细胞氧化应激的保护作用及机制

汪秀+李菲+黄利辉

摘要：研究油茶籽壳总黄酮（CSF）对黄曲霉毒素B1（AFB1）诱导的人肝细胞（HL-7702）氧化应激的保护作用及其机制。以20 μg/mL AFB1处理2 d建立HL-7702细胞AFB1损伤模型；与AFB1损伤组比较，25、50、100 μg/mL CSF预处理HL-7702细胞1 d，细胞存活率显著上升（P<0.05），细胞内活性氧（ROS）和脂质过氧化物丙二醛（MDA）水平显著下降（P<0.05），超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著升高（P<005），核因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游谷胱甘肽S转移酶A2（GSTA2）的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），核转录因子κB（NF-κB）及下游炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的mRNA表达显著下降（P<0.05）。因此，油茶籽壳总黄酮通过上调Nrf2，提高Nfr2下游抗氧化酶系的活性，阻断了由ROS引起的脂质过氧化链式反应，同时下调NF-κB，减少炎症因子相关基因的表达，从而拮抗AFB1对肝细胞的毒性损伤，提高了肝细胞存活率。

关键词：油茶籽壳；总黄酮；黄曲霉毒素B1；氧化应激；细胞保护

中图分类号： R284.1

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0308-04

由黄曲霉、寄生曲霉产生的黄曲霉毒素B1（AFB1）经常被发现于发霉变质的饲料、食物中，被认为是中毒性最强、危害最大的一种霉菌毒素[1]。生物体摄入AFB1后，在不同器官诱发产生细胞内活性氧（ROS），破坏机体的氧化-抗氧化平衡，从而使脂质过氧化物丙二醛（MDA）积累，对脂类、蛋白质、DNA等生物大分子造成损伤[2]，由此形成的氧化应激对肝脏的损伤是最大的[3]。研究表明，植物黄酮类物质能吸收包括AFB1在内的多种霉菌毒素，减轻其对动物体的损伤，保护肝脏，从而改善牲畜健康，提高畜产品产量。人参皂苷[4]、槲皮苷[5]、柚皮苷[6]、藤黄双黄酮[7]等都被发现具有黄曲霉毒素细胞保护作用。然而，至今仍然没有一种商业化的AFB1生物保护剂，主要是由于上述具有细胞保护作用的化合物来源十分有限，价格昂贵。因此，寻找易获得、廉价的此类化合物来源（如农副产品）十分必要。我国是世界上油茶籽产量最大的国家，油茶籽壳是油茶籽榨油前除去的种皮，大量的废弃茶籽壳一般被丢弃或用作燃料，既污染环境又浪费资源。研究表明，油茶籽壳中含有丰富的黄酮类物质[8]，关于这类黄酮类物质提取工艺的研究已经很多，但对其功能研究目前仅局限在证明其具有较好的体外抗氧化性能[9-10]。因此，笔者推测油茶籽壳中的黄酮类物质所具有的抗氧化能力可以减轻AFB1对细胞的毒性作用。本研究采用AFB1最易损伤的正常肝细胞HL-7702细胞为材料，建立AFB1肝细胞损伤模型，探讨油茶籽壳中黄酮类物质对AFB1肝细胞损伤的保护作用及其可能机制，旨在为油茶籽壳的综合高效利用和天然AFB1生物保护剂开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 油茶籽壳总黄酮（CSF）样品制备

油茶籽购自浙江省嘉兴市农贸市场，剥壳后自然晒干即得油茶籽壳，粉碎后备用。取5 g油茶籽壳粉碎样品，依照姜天甲等[9]和高扬等[11]的方法，按1 g ∶30 mL比例加入60%乙醇溶液，浸泡30 min，40 ℃超声波提取45 min，滤液减压浓缩后加蒸馏水定容至50 mL，加等体积石油醚充分振荡，静置分层后分离收集，经40 ℃真空减压旋转蒸发后，制备得油茶籽壳总黄酮并用DMSO配成20 mg/mL储备液，-20 ℃保存。

1.2 材料

人正常肝细胞系HL-7702购于中国科学院上海细胞库；AFB1、DMSO、MTT均为Sigma公司产品，AFB1溶解于DMSO 中，配成1 mg/mL母液；RPMI-1640培养基、胰酶、青链霉素均为HyClone公司产品；胎牛血清购于四季青公司；MDA试剂盒，SOD、CAT、GSH-Px测定试剂盒购于南京建成工程研究所；ROS检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PCR试剂盒、TRIzol、脱脂牛奶（BSA）均为碧云天公司产品；PrimeScript RT反转录试剂盒购于TaKaRa公司；小鼠抗人Nrf2、GSTA2、β-actin单克隆抗体均为Santa Cruz公司产品；HRP标记的山羊抗小鼠IgG购于武汉博士德生物公司；PCR引物均合成自上海博尚生物公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 人HL-7702正常肝细胞以RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、1%双抗）于37 ℃、5%CO2培养。

1.3.2 AFB1致HL-7702细胞损伤模型建立 采用MTT法检测HL-7702细胞增殖抑制率，试验分为对照组和AFB1组。HL-7702细胞按5 000个细胞/孔接入96孔板中，每组设5个复孔，过夜培养待细胞贴壁后加化合物。对照组每孔加入含1%DMSO的完全培养基100 μL，AFB1组每孔加入含5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL AFB1的完全培养基100 μL。各组分别培养0.5、1、2 d后弃去孔内培养基，并加入100 μL含 MTT溶液（终浓度0.5 mg/mL）的无血清培养基，避光37 ℃孵育4 h，弃上清液，每孔加100 μL DMSO，振荡使结晶物充分溶解，570 nm下测定各孔吸光度，细胞抑制率=（D对照-D试验）/ D对照×100%。根据MTT结果，选择AFB1的最佳浓度进行后续试验。

1.3.3 油茶籽壳总黄酮对AFB1致细胞损伤的预保护试验 细胞接板和MMT检测方法同“1.3.2”节，试验分组如下：设正常对照组、AFB1模型组和油茶籽壳总黄酮低剂量、中剂量、高剂量保护组。正常对照组：细胞先用含1%DMSO（CSF的溶剂）的完全培养基培养1 d，换液后再加入含1%DMSO（AFB1的溶剂）的完全培养基继续培养2 d；AFB1模型组：细胞先用含1%DMSO（CSF的溶剂）的完全培养基培养1 d，换液后加入含有最佳损伤浓度AFB1（20 μg/mL）的完全培养基继续培养2 d；CSF保护组：细胞先分别与含25、50、100 μg/mL CSF的完全培养基预孵1 d，换液后加入含有最佳损伤浓度AFB1（20 g/mL）的完全培养基继续培养2 d。3 d培养结束后检测细胞存活率，细胞存活率计算公式如下：

细胞存活率=D试验/ D对照×100%。（1）

1.3.4 HL-7702细胞内MDA生成量的检测 采用 “1.3.3”节所述方法处理HL-7702细胞，用硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA含量[12]。将各组细胞裂解后按照试剂盒说明书操作步骤进行操作，在532 nm处测定各孔吸光度，采用BCA试剂盒说明书规定的方法测定总蛋白浓度。

1.3.5 HL-7702细胞内ROS水平的检测 采用 “1.3.3”节所述方法处理HL-7702细胞，采用二氯荧光素双乙酸（DCFH-DA）法测定细胞内ROS水平。将各组细胞裂解后按照试剂盒说明书操作步骤进行，细胞裂解液与10 nmol/L DCFH-DA 37 ℃孵育30 min后，PBS洗细胞2次。荧光强度用荧光酶标仪以激发波长485 nm 和发射波长535 nm检测。ROS相对含量计算公式如下：

ROS相对含量=处理组荧光强度/对照组荧光强度×100%。（2）

1.3.6 HL-7702细胞内抗氧化酶系含量测定 采用 “1.3.3”节所述方法处理HL-7702细胞，收集各组细胞，用冰PBS洗，然后在冰上用超声破碎机200 V、30 s，间隔5 s，3次破碎细胞，取100 L细胞裂解液，按照试剂盒说明书操作步骤测定SOD、CAT、GSH-Px酶活性。酶活性以酶比活力单位（U/mg）表示，并用细胞总蛋白质含量作校正。

1.3.7 RT-PCR检测相关基因的改变 采用 “1.3.3”节所述方法处理HL-7702细胞，收集各组细胞，提取细胞总RNA，采用PrimeScript RT反转录试剂盒并进行逆转录，得到各组细胞cDNA。PCR扩增条件均为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 8 min；循环数30。最后PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳分离，检测基因引物见表1，GAPDH为内参。

1.3.8 Western blot检测蛋白表达的改变 采用 “1.3.3”节所述方法处理HL-7702细胞，收集细胞，用PBS洗涤3次，加入裂解液，冰上充分裂解1 h，总蛋白样品进行SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别用稀释的Nrf2、GSTA2和标准内参β-actin一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后加稀释的二抗室温孵育2 h，加ECL发光试剂，显影、定影。

1.3.9 统计学分析 所有试验均重复3次，数据采用x±s表示，采用SPSS 18.0软件统计分析，采用Duncans检验多重比较。

2 结果与分析

2.1 HL-7702细胞AFB1受损模型的建立

由图1可见，AFB1对HL-7702的细胞毒性呈现出剂量和时间依赖性。0.5、1 d组各浓度虽也可以明显抑制细胞增殖，但彼此之间差异不大，2 d组各浓度对应的细胞抑制率之间差异明显，且浓度与抑制率之间相关性好（r2=0.99），因此以2 d组数据确定AFB1的IC50浓度为20 μg/mL，以 此 作 为AFB1对HL-7702细胞损伤模型的最佳浓度。

2.2 油茶籽壳总黄酮对AFB1损伤的HL-7702细胞存活率的影响

将未经油茶籽壳总黄酮预处理的HL-7702细胞暴露于20 μg/mL AFB1 2 d，与对照组相比，细胞存活率明显下降（表2）。经25、50、100 μg/mL油茶籽壳总黄酮预保护过的HL-7702细胞再接受相同样剂量AFB1暴露相同时间后，细胞存活率较AFB1损伤组明显提高，且其保护效果呈显著的剂量效应关系。油茶籽壳总黄酮对HL-7702细胞进行预处理可以有效抑制AFB1造成的细胞增殖抑制。

2.3 HL-7702细胞内ROS和MDA水平的改变

由表3可知，与对照组相比，20 μg/mL AFB1作用HL-7702细胞2 d，显著增加了HL-7702细胞内ROS活性和MDA含量，说明AFB1造成了HL-7702细胞的氧化损伤。经25、50、100 μg/mL油茶籽壳总黄酮预处理后，受损细胞内的ROS活性逐渐降低，与AFB1损伤组相比差异显著，MDA含量也随着油茶籽壳总黄酮浓度升高而显著下降。

2.4 HL-7702细胞内抗氧化酶系的改变

由表4可见，与对照组相比，20 μg/mL AFB1作用HL-7702细胞2 d，显著降低细胞内抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性，说明细胞内源性抗氧化酶系统功能失调。经25、50、100 μg/mL油茶籽壳总黄酮预处理HL-7702细胞1 d，与AFB1损伤组相比，25 μg/mL保护组没有显著提升HL-7702细胞内CAT、GSH-Px活性。

2.5 HL-7702细胞内Nrf2及其下游抗氧化酶表达的改变

Nrf2被称为氧化还原敏感转录因子，是调节抗氧化应激反应的重要转录因子[16]。与对照组相比，AFB1损伤组Nrf2及其下游GSTA2的mRNA（图2-a）和蛋白表达水平（图2-b）均明显下调。随着油茶籽壳总黄酮预保护浓度的提高，与AFB1损伤组相比，Nrf2及GSTA2的mRNA和蛋白表达水平都呈现剂量依赖性上调。GSTA2是Nrf2调控的下游众多抗氧化蛋白之一，SOD、CAT、GSH-Px也受Nfr2的调控，由此可知，油茶籽壳总黄酮在细胞氧化应激的情况下，通过上调Nrf2表达，提高了其下游一系列抗氧化酶的活性，从而对抗由AFB1造成的细胞氧化损伤。

2.6 细胞内NF-κB及下游炎症因子mRNA表达的改变

研究表明，肝细胞遭受氧化受损及肝炎、肝癌发生时NF-κB信号通路被显著激活[17-18]。由图3可知，与对照组相比，AFB1损伤组核转录因子NF-κB表达明显上调，其相关下游炎症介导因子TNF-α、IL-6、IL-1β也随之高表达，随着油茶籽壳总黄酮预保护浓度的提高，与AFB1损伤组相比，NF-κB及炎症因子表达都呈现剂量依赖性下调。由此可知，油茶籽壳总黄酮对HL-7702细胞的预处理下调了由AFB1引起的NF-κB信号通路的激活，相关炎症因子表达随之减少，提示其在预防、治疗肝炎方面可能具有的功能。

3 结论与讨论

生物有氧代谢过程中产生的过多活性氧（ROS）会导致氧化应激，肝脏因含有丰富的线粒体，是产生ROS较多的器官，也是较易受到ROS攻击的器官。氧化应激会引起脂质过氧化，破坏酶活性，损伤DNA，造成肝损伤。研究表明，氧化应激与多种肝脏疾病、肝功能障碍密切相关[19]。AFB1进入肝细胞后，通过环氧化反应转变为有活性的AFB1-8，9环氧化合物，进而引发肝细胞内产生过量ROS，造成细胞的氧化应激，这是AFB1生物毒性尤其是肝脏毒性发生的主要机理[20]。

本研究表明，当肝细胞遭遇AFB1损伤时，油茶籽壳总黄酮与肝细胞的预孵显著降低了细胞内ROS、MDA水平，同时提升了肝细胞内抗氧化酶系（SOD、CAT、GSH-Px）的活性，因此改善了肝细胞AFB1暴露下的氧化-抗氧化平衡环境，提高了细胞存活率。El-Nekeety 等[3]、 Zhang等[21]、Hou等[22]都曾报道过：当细胞暴露于霉菌毒素时，天然抗氧化剂可以增强细胞内抗氧化酶活性，阻断脂质过氧化，从而缓解细胞的氧化应激。Nrf2是公认的细胞防御过氧化应激的重要调节因子，在氧化应激状态下，Nrf2与细胞核内抗氧化反应元件ARE结合，上调一系列解毒酶和抗氧化蛋白表达，从而增强肝细胞的解毒及抗氧化能力，减轻活性氧（ROS）和亲电子物质介导的细胞损害，对保护肝脏功能、阻止多种肝脏疾病的发生有着重要意义[23]。已经证明能通过Nrf2途径改善肝细胞氧化应激状态，进而发挥保护肝细胞作用的化合物有白藜芦醇[24]、姜黄素[25]、齐墩果酸[26]、熊去氧胆酸[27] 等，这些化合物主要集中在对肝细胞的乙醇或其他药物损伤方面的保护，由于这些化合物的来源十分有限，限制了其更为广泛的应用。本研究表明，来自油茶籽壳中的总黄酮物质与肝细胞的预孵上调了Nrf2、GSTA2表达，GSTA2是Nrf2调控的下游众多抗氧化蛋白之一，与肝脏解毒功能有关，SOD、CAT、GSH-Px也受Nfr2调控，抗氧化酶是细胞内对抗ROS的主要防御机制，因此可以认为油茶籽壳总黄酮预处理肝细胞后激活了Nfr2信号通路，上调其下游多种抗氧化酶基因的表达，提高细胞内抗氧化酶活性，从而对抗由ROS引起的肝细胞氧化损伤，起到保护肝细胞的作用。Costa等也报道了黄酮类物质在上调Nrf2蛋白和提高抗氧化酶活性方面的重要作用[28]。

细胞内产生过量ROS除了会导致MDA积累外，还可激活NF-κB信号通路，进而使其下游调控的许多炎症因子（包括TNF-α等）表达增加，持续释放，肝细胞氧化应激、凋亡，炎症细胞大量浸润，最终导致肝炎甚至引发肝癌[29] 。本研究表明，油茶籽壳总黄酮的预处理使得肝细胞NF-κB表达下降及其调控的炎症因子（TNF-α、 IL-6、IL-1β）下调，这提示其在预防、治疗肝炎方面可能具有的功能。油茶籽壳总黄酮通过上调Nrf2，提高Nfr2下游抗氧化酶系（SOD、CAT、GSH-Px、GSTA2）的活性，阻断了由ROS引起的脂质过氧化链式反应，同时下调NF-κB，减少炎症因子相关基因（TNF-α、IL-6、IL-1β）的表达，从而拮抗AFB1对肝细胞的毒性损伤，提高肝细胞存活率。油茶籽壳作为一种农业副产品，在我国资源丰富、价格低廉，本研究证明了其中的黄酮类物质具有拮抗AFB1肝细胞毒性的功能，为油茶籽壳的环保、高效利用提供了新途径。

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