基于引物“随机组合”构建观赏桃SSR指纹图谱

王清明, 程　怡, 马建伟, 张云婷, 张　勇*

( 1. 四川农业大学 园艺学院， 成都 625014； 2. 广元市农业科学研究院， 四川 广元 628017 )

基于引物“随机组合”构建观赏桃SSR指纹图谱

王清明1,2, 程怡1, 马建伟1, 张云婷1, 张勇1*

( 1. 四川农业大学 园艺学院， 成都 625014； 2. 广元市农业科学研究院， 四川 广元 628017 )

摘要：近年来，我国观赏桃新品种日渐繁多、名称混乱、市场难以监管，同时用以区分品种的SSR指纹图谱的构建方法在研究界无统一的科学标准，尤其是构成最终引物组合的核心引物的确定，具体操作流程层出不穷、五花八门。为探索筛选SSR指纹图谱核心引物的科学方法，同时构建观赏桃SSR指纹图谱，该研究选用35对已报道的SSR引物对22份观赏桃种质进行试验。结果表明：通过PCR扩增与分析，多态性较高的8对引物——候选引物总共扩增出31个多态性条带，变幅为3～5个，PIC值变幅为0.458～0.668，MI值变幅为1.374～3.340。采用“随机组合”法对8对引物进行…依次分析，得到区分能力最强的3种不同的最少引物组合方式——候选组合，并能区分出18份种质，从中发现区分能力最强的3种引物组合方式并不都是由引物PIC值、alleles数量或MI值等多态性指标最高的引物组成，而是由互补性最强的引物组成。选用组合内各引物多态性条带总数最多的组合方式“4-3”(BPPCT001+BPPCT015a+BPPCT017+BPPCT025)为22份观赏桃种质构建了指纹图谱。基于此，通过常规多态性指标筛选候选引物可以确定出单对引物鉴别能力最强的少量引物；通过“随机组合”筛选候选组合可以进一步确定出引物之间互补性最强的几种组合方式；根据组合内各引物的多态性条带总数确定最终核心引物可以确定出可扩容性最大的引物组合。该研究最终建立了候选引物——候选组合——核心引物组合“三步法”确定SSR指纹图谱核心引物组合的科学方法，不仅为22份供试观赏桃种质构建了SSR指纹图谱，也为其它作物SSR指纹图谱的构建提供了新的思路。

关键词：观赏桃， 种质， SSR标记， 分子身份证， 引物组合法

观赏桃(Ornamental peach)又称桃花，属于蔷薇科李属植物，包括桃(Prunuspersica)以及桃与其近缘种的杂交种(胡东燕和张佐双，2010)，如‘白花山碧桃’。据文物考证，桃在我国可追溯到6 000～7 000年前的新时代时期(汪祖华和庄恩及，2001)，而以花见长的观赏桃在唐朝就有专门栽培(王仁裕和丁如明，1985)，桃花品种到清代已是琳琅满目(陈淏子和伊钦恒，1985)。观赏桃在国外同样受到青睐，其发展遍及五洲各地，它明艳的气质深刻影响着世界园林历史的变迁(Everett，1967)。观赏桃的双重授粉方式(自花授粉和异花授粉)极大丰富着其种质资源，据2004年的一次统计约有267个桃花名称(胡东燕，2004)。近10年来，以中国农业科学院郑州果树研究所、江苏省农业科学院园艺研究所和北京市农林科学院林业果树研究所等单位为主要阵地的观赏桃新品种选育研究极大地推动了观赏桃种质资源的发展(俞明亮等，2010)。品种的丰富致使“一物多名，一名多物”的现象在观赏桃上时有发生，这个观赏桃种质创新工作和商品流通都造成了很大障碍。因此，给不同的观赏桃种质冠以独一无二的特异标识成为亟待之求。

随着SSR (Simple Sequence Repeat) 标记在不同物种中深度开发，SSR指纹图谱(Fingerprint)在近年来蓬勃发展。SSR指纹图谱是利用SSR扩增条带为种质建立特异身份标识的一种DNA分子图谱，或称分子身份证(Molecular ID)。2005年，SSR标记操作简单、单位点扩增以及实验室间的高重复性等优势促成了国际植物品种权保护组织(UPOU)明确将其确定为构建品种指纹数据库的标准方法(Jördens，2005)。按照组成SSR指纹图谱所需的引物数量可以分为特征谱带法和引物组合法。特征谱带法可以追溯到1984年，英国遗传学家Jefferys et al(1985)首次获得人源小卫星DNA与人体核DNA酶切片段的杂交带图纹，并以此命名为指纹图谱(Fingerprint)，它是将单对(条)引物或探针在种质上扩增出的特异条带作为该种质的指纹图谱。但特征谱带法的开放性和可容性差，难以在大规模的种质鉴定中发挥作用。2000年，郭景伦等(2000)率先利用引物组合法在国内构建了玉米的RAPD指纹图谱。经过10余年的发展，引物组合法中的核心引物法在SSR指纹图谱的运用中越来越受到青睐。但遗憾的是，筛选核心引物作为构建SSR引物的关键步骤之一，在以往的实践中未见统一的标准。大多研究是以等位基因多态性条带数量(Polymorphic bands)、多态信息含量(Polymorphism information content，PIC)和标记索引指数(Mark index，MI)等多态性指标为标准进行选择。例如：麻丽颖等(2012)单纯依靠各引物的alleles数目来选择核心引物， 陈昌文等(2011)以PIC值为主要标准逐一剔除对引物组合鉴定能力影响最小的引物来最终确定核心引物。引物组合法的精髓在于利用了不同引物在种质上的扩增效果具有差异的特点，它将多对引物的扩增条带进行有序组合，进而形成不同种质独一无二的指纹图谱。因此，充分利用不同引物扩增效果的互补性和降低核心引物组合扩增效果的冗余性，方可实现引物组合的最大效力。传统的筛选方法单纯依靠多态性指标，虽可以找到鉴别效力极高的引物，但是忽略了不同引物之间的效力重叠与互补的问题，即引物的多态性高低和由该引物组成的引物组合的多态性高低不能直接画等号。

表 1　供试观赏桃材料

SSR指纹图谱不仅在玉米(盖树鹏等，2011)、水稻(陆徐忠等，2014)等大宗作物中取得了成功，且在桃等多种园艺植物中频有报道。陈昌文等(2011)为176份桃品种构建了SSR指纹图谱，为今后有关桃的SSR指纹图谱研究提供了宝贵经验。但这项研究的材料主要集中在食用桃品种，而对于近5年来新报道的观赏桃品种和观食两用桃品种却较少涉及，如‘贺春’(刘佳棽等，2010)、‘报春’(朱更瑞等，2011)、‘锦春’(刘佳棽等，2011)、‘红菊花’(王力荣等，2011)等。该研究基于引物组合“合力”考虑，将“随机组合”引入核心引物筛选的环节中，以期找到筛选核心引物的科学方法，并以此方法为22份观赏桃种质构建SSR指纹图谱。

1材料与方法

1.1 供试材料和DNA提取

22份观赏桃种质来自四川农业大学教学科研园区，主要引自北京市农林科学研究院和中国农业科学院郑州果树研究所。每份种质分别调查统计20个个体，按胡东燕等(2010)对观赏桃不同树型、叶色、花型和花色等主要形态学性状的界定标准，对22份种质进行描述(表1)。同时，从每份种质中选取20个个体进行混合取样，摘取春季幼嫩新叶，采用刘燕(2011)优化的CTAB法提取总DNA。

1.2 SSR-PCR反应

SSR引物来源于Dirlewanger et al(2002)报道在桃上的35对单位点扩增引物。

PCR扩增在Bio-rad DNA Engine Single bay PCR仪 (eppendorf，德国)上进行。反应体系为25 μL：DNA模板40 ng，引物各10×10-9mol，Mg2+50×10-6mol，dNTPs 7.5×10-6mol，10×Buffer (free Mg2+) 2.5 μL，Taq酶2 U，所有试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。扩增程序是94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，32个循环；72 ℃延伸5 min。退火温度根据生工生物工程(上海)股份有限公司提供的引物使用说明进行调整。

用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，用快速银染法(高东等，2009)进行染色。为保证试验的重复性，具有多态性的引物在最适条件下重复扩增2次，若电泳结果不一致，则增加第3次试验，以能够重复的结果为准。

1.3 数据分析

在相同电泳迁移率位置上，有扩增条带记为1，无则记为0，从而建立起0，1格式矩阵，统计各引物产生的等位基因数量(alleles数目)、多态性信息量(polymorphism information content，PIC)和标记索引系数(maker index，MI)。PIC值由公式“PICi=1-∑Pij2”计算(Senior et al，1998)；MI值由公式“MI=alleles数目×PIC”计算(Smith et al，1997)。以“引物使用最少”为原则，确定核心引物组合。用“+、-”式构建SSR指纹图谱(陈琛等，2011)。

2结果与分析

2.1 扩增结果

选取多态性较高、稳定性较好的8对引物对22份种质进行分析(表2，表3)。8对引物在22份材料中共扩增出31个条带，且都是多态性条带，多态位点百分率为100%，单对引物扩增条带数变幅为3～5，平均每对引物扩增出约3.9个多态性条带，扩增条带最多的5对引物分别是BPPCT001、BPPCT017、BPPCT037、BPPCT015a、BPPCT025；8对引物的PIC值变幅为0.458～0.668，平均为0.527，大小排前五的引物依次是BPPCT001、BPPCT025、BPPCT017、BPPCT007和BPPCT023；8对引物的MI值变幅为1.374～3.340，平均为2.055，大小排前五的引物依次是BPPCT001、BPPCT017、BPPCT037、BPPCT025和BPPCT015a。三个指标在各引物中大小排序不完全一致。

2.2 引物组合

2.2.1 特征谱带法35对引物中，BPPCT014、BPPCT015a和BPPCT017分别产生1、2和2个特征条带。其中，PIC值仅为0.082的引物BPPCT014能够区分‘白重瓣垂枝’，且其他所有品种的谱带相同(图1)；而PIC值较大的BPPCT015a、 BPPCT017各自产生的2个特征图谱能够分别区分出‘贺春’和‘单瓣垂枝’(图2)、‘寿红’和‘白重瓣垂枝’(图3)。

表 2　8对SSR引物序列信息表

表 3　8对SSR引物的多态性信息

图 1　引物BPPCT014在22份观赏桃种质上扩增结果Fig. 1　Amplification of BPPCT014 on 22 ornamental peach germplasms

图 2　引物BPPCT015a在22份观赏桃种质上扩增结果Fig. 2　Amplification of BPPCT015a on 22 ornamental peach germplasms

图 3　引物BPPCT017在22份观赏桃种质上扩增结果Fig. 3　Amplification of BPPCT017 on 22 ornamental peach germplasms

表 4　8对引物的随机组合

表 5　四引物组合各指标总和

综合表3和表4的数据可以看出，3种“候选组合”所覆盖的5对引物(BPPCT001、BPPCT007、BPPCT015a、BPPCT017、BPPCT025)其多态性条带数目、PIC值、MI值均比较高。但这个现象并不绝对，例如，BPPCT007的多态性条带数目和MI值均低于BPPCT037，却被2种“候选组合”选中，而BPPCT037相应地被摒弃；BPPCT015a作为3种“候选组合”的必须引物，其PIC值大小在8对引物中仅排名第7。

2.3 指纹图谱

3种“候选组合”中，“4-3”(BPPCT001+ BPPCxT015a+ BPPCT017+ BPPCT025)的总多态性条带数目、总PIC值和总MI值均最大(表5)。将总多态性条带数目最大的组合“4-3”确定为最佳随机组合，即核心引物组合， 并为22份观赏桃种质构建SSR

表 6　22个观赏桃品种的SSR指纹图谱

指纹图谱(表6)。

3讨论与结论

3.1 引物多态性

扩增结果揭示了本研究中的8对引物的多态性比较丰富。在引用相同引物来源的桃的研究中，陈霁等(2010)在42份观赏桃种质中平均每对引物扩增出7.75个多态性条带，陈昌文等(2011)在176份中国桃种质中平均每对引物扩增出12.7个多态性条带，都高于本研究中的3.9个多态性条带。但这并不反映本研究中的引物多态性低，相反，它只从实践上验证了供试种质数量越大，遗传背景越丰富，种质之间的变异空间越大，越容易扩增出更丰富的多态性条带。本研究8对引物的多态性条带比例均为100%，高于陈霁等(2010)的研究，PIC值变幅为0.458～0.668，MI值变幅为1.374～3.340，足见其多态性均比较丰富。

3.2 核心引物确定

最早的指纹图谱可以归结为特征谱带法，是利用单对引物对具有特殊谱带的种质进行标记；但当供试的种质材料数目扩大时，特征谱带法的特殊谱带有可能失去其特殊性。为解决特征谱带法的局限性，郭景伦等(2000)提出了引物组合法，它利用不同引物间的特异性“互补”来为种质构建组合指纹(后称“复指纹”)，然后以“复指纹”的形式来实现对规模较大的种质进行区分。由这种“复指纹”所构建的指纹图谱在理论上具有更好的“扩容性”，即当新的种质加入并获得其特有“复指纹”时，群体内原有种质的特殊“复指纹”能够继续保持其特殊性。“扩容性”的大小可以反映出引物组合对种质的区分能力，而“扩容性”的大小不仅与组合中各引物自身的多态性有关，更直接取决于引物组合的多态性。因此，核心引物的选择至关重要，其选择程序应具有科学性。王凤格等(2003)便指出了核心引物的筛选应遵循一定的算法。

随着种质资源的日益丰富，商业流通对构建DNA指纹图谱有着深刻要求；再者，由于种质之间遗传信息不断交叉，不同种质的区分难度也不断增加，各物种高质量的核心引物组合亟待确立。笔者倡议以“三步法”确立核心引物组合的引物：首先以稳定重复性、alleles数目、PIC值等为第一、二、三…指标选出“候选引物”，然后以“随机组合”从“候选引物”中选出“候选组合”，最后分别以总alleles数目、PIC值等为第一、二…指标确定出最佳随机组合，即核心引物组合。

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ZHANG JZ, WEI SL, SUN JM， et al. Bulblet formation and development of Lanzhou lily (Liliumdavidiivar.unicolor) by tissue culture [J]. Guihaia， 2016， 36(3)：297-302

Abstract: Bulblet formation and development of Lanzhou lily (Liliumdavidiivar.unicolor) by tissue culture could provide technical solutions to realize the mass production of Lanzhou lily bulblet, which needs three steps to achieve, including multiple shoots proliferation, induction of bulblets and enhancement growth of bulblets. The starch content and the characteristic parameters of bulblet were detected at different culture stages. This study acquired an advanced technique that could effectively promote the bulblet formation and development, and induce the growth of main stem. The results demonstrated that the bulblet diameter, weight and number of scales were up to 1.66 cm, 2.48 g and 26.33 pieces, respectively. The starch content showed a gradual increasing trend according to the culture process, which indicated that the starch content was positively correlated to the development of bulblet. In addition, the bulblet size, weight and number of scales showed a positive correlation. The growing point of bulblet was easy to form the main stem when the number of scales reached to 26 or more. In this paper, the invented three-step tissue culture technology effectively promotes bulblet enhancement development, and enlargement of the bulblet can effectively shorten the field growth cycle, improve lily production on time, and also, it can provide technical reference for achievement of mass production of enhancement bulblet.

Key words:Liliumdavidiivar.unicolor, bulblet, development, starch, plant hormone

CLC number： Q943.1, S644.1Document code： AArticle ID： 1000-3142(2016)03-0297-06

Construction of SSR fingerprint for ornamental peach based on primers “random combination”

WANG Qing-Ming1，2, CHENG Yi1, MA Jian-Wei1, ZHANG Yun-Ting1, ZHANG Yong1*

( 1.CollegeofHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity, Ya’an 625014, China； 2.GuangyuanAcademyofAgriculturalSciences， Guangyuan 625014， China )

Abstract:In the recent years, the nomenclature of the cultivars of ornamental peach in China is falling into mess under the rapidly increasing of new cultivars. This makes it more and more hardly to deal with the market regulation. Meanwhile, there is no statistically unified scientific standard for the methods of constructing SSR fingerprint in research community, especially for filter the core primers that consisted of the finally unique group, the concrete operating procedures are plenty, variable and mess. In order to explore the statistically unified scientific method for filtering the core primers of the finally unique group and construct the SSR fingerprint for experimental ornamental peach, we selected 35 pairs of SSR primers reported previously to test on 22 ornamental peach germplasms. After PCR amplification and analysis firstly, 8 pairs of primers among them with high polymorphism called “candidate primers” were detected 31 polymorphism bands in total, ranging from 3-5 per pairs of primer. And the 8 pairs of primers gained 0.458-0.668 in PIC values and 1.374-3.340 in MI values correspondingly. Secondly, we analyzed …successively by “random combinations” method, obtained 3 different primer combinations consisting with lest of primers called “candidate combination”, which possessed the strongest discrimination ability. All of the three could distinguish 18 accessions. And the 3 best primer groups were not consisted with the series of primers which possessed high leaves of PIC values, MI values or high numbers of alleles and so on, but a series primers which possessed an high leaves of complementarity. Lastly, the combination “4-3” (BPPCT001+BPPCT015a+BPPCT017+BPPCT025), which possessed the most polymorphism bands in total of the primers among groups, was finally chosen to establish the fingerprint for the 22 ornamental peach germplasms tested. The rerults showed that to filter candidate primers according to routine polymorphic index could select the few pairs of primers which possessed the strongest discrimination ability per pairs of primer; to filter candidate combination according to “random combination” could furtherly select the few compound modes which possessed the strongest complementarity; to filter core primer combination according to numbers of the bands in total of primers among groups could finally select the unique group which possessed the largest expandable sex. Therefore, “3 steps” for candidate primers-candidate combination-core primer combination was advocated as a scientific method to fitter the core primers of SSR fingerprint. It did constructed the SSR fingerprint for the 22 ornamental peach germplasms tested, and would provide a new approach to construct SSR fingerprints for other crops.

Key words:ornamental peach， germplasm， SSR marker， molecular ID， primer combination method

Bulblet formation and development of Lanzhou lily (Liliumdavidiivar.unicolor) by tissue culture

ZHANG Jin-Zhong1, WEI Shao-Long1, SUN Jia-Man2,HAN Yuan-Shan1, ZHOU Wei1

( 1.BiologicalTechnologyInstituteofGuangxiAcademyofAgriculturalSciences, Nanning 530007, China;2.GuangxiKeyLaboratoryforCropGeneticImprovementandBiotechnology, Nanning 530007, China )

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201408028 10.11931/guihaia.gxzw201407020张进忠， 韦绍龙， 孙嘉曼， 等. 兰州百合组培鳞茎发育研究 [J]. 广西植物， 2016， 36(3)：297-302

收稿日期:2014-12-28修回日期： 2015-03-24

基金项目：四川省教育厅重点项目(12ZZ011)；四川农业大学学科建设“双支”计划项目；教育部留学归国人员资助项目[Supported by the Key Project of Sichuan Education Department(12ZZ011); Project Sponsored by SCAU; Foundation for Returned Overseas Students of Sichuan Province]。

作者简介：王清明(1990-)，男，四川达州人，硕士，主要从事园艺植物种质资源与遗传育种研究，(E-mail)332686960@qq.com。 *通讯作者： 张勇，博士，副教授，主要从事园艺植物种质资源与遗传育种研究，(E-mail)zhyong@sicau.edu.cn。

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：1000-3142(2016)03-0289-08

王清明, 程怡, 马建伟， 等. 基于引物“随机组合”构建观赏桃SSR指纹图谱 [J]. 广西植物， 2016， 36(3)：289-296

WANG QM, CHEN Y, MA JW, et al. Construction of SSR fingerprint for ornamental peach based on primers “random combination” [J]. Guihaia， 2016，36(3)：289-296